Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 803589), de la Fondation israélienne pour la science (subvention ISF n° 1815/18) et des subventions Canada-Israël (CIHR-ISF, subvention n° 2591/18). Nous remercions Nechama Novick d’avoir commenté l’ensemble du manuscrit.

Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université hébraïque et respectaient les directives du Guide de l’Institut national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Transduction du vecteur viral
REMARQUE: La transduction du vecteur viral est utilisée pour exprimer les fluorophores dans le cerveau.
<ol><li>Utilisez un atlas (p. ex., All...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Les méthodes de nettoyage des tissus présentent un outil révolutionnaire dans la recherche sur le cerveau, invitant à des questions qui n’auraient pas pu être posées auparavant. En ciblant les propriétés d’un petit groupe de cellules, d’une seule cellule ou même d’une seule synapse, CLARITY permet désormais de cibler des populations cellulaires totales ou des caractéristiques de connectivité à longue portée en utilisant des fluorophores pertinents.
Le résultat de l’exp...

Au cours des dernières années, la connaissance de la fonction des astrocytes et de la façon dont ils interagissent avec les circuits neuronaux a considérablement augmenté. Les astrocytes peuvent influencer la plasticité 1,2, aider à la récupération neuronale post-blessure 3,4, et même induire une potentialisation neuronale de novo, avec des études récentes montrant l’importance des astrocytes dans l’acquisition de la mémoire et la récompense, auparavant considérées comme des fonctions purement neuronales 5,6,7 . Une caractéristique particulièrement intéressante dans la recherche sur les astrocytes est la disposition spatiale des cellules, qui maintiennent des organisations spatiales uniques dans l’hippocampe et d’autres structures cérébrales 8,9,10. Contrairement aux dendrites neuronales qui s’entrelacent entre les somata cellulaires, les astrocytes de l’hippocampe habitent des territoires visuellement distinguables avec un léger chevauchement entre leurs processus, créant des domaines distincts 8,11,12,13. Les preuves soutenant la participation des astrocytes dans les circuits neuronaux ne soutiennent pas l’absence de description anatomique détaillée de ces populations et des neurones dans leurs domaines14.
Les procédures de transduction des vecteurs viraux, ainsi que les animaux transgéniques (TG), ont été popularisés comme un ensemble d’outils pour étudier les structures cérébrales, les fonctions et les interactions cellulaires15,16. L’utilisation de différents promoteurs permet de cibler des cellules spécifiques en fonction de leurs propriétés génétiques, de leurs niveaux d’activation17,18 ou de leurs cibles de projection. Différents virus peuvent exprimer des fluorophores de différentes couleurs dans différentes populations. Un virus peut être combiné avec l’expression endogène de fluorophores dans la TG, ou les animaux TG peuvent être utilisés sans avoir besoin de virus. Ces techniques sont largement utilisées pour le marquage neuronal, et certains laboratoires ont commencé à les utiliser avec des modifications spécialisées pour cibler d’autres types de cellules, telles que les astrocytes 5,9,19.
La technique CLARITY, décrite pour la première fois en 201320,21, permet d’étudier des tranches de cerveau épaisses en rendant l’ensemble du cerveau transparent tout en laissant les structures microscopiques intactes. En combinant les deux méthodes - transduction du vecteur viral et nettoyage des tissus - l’option d’examiner les interactions spatiales entre différentes populations de type cellulaire est maintenant disponible. La plupart des études d’interaction astrocyte-neurone ont été réalisées sur de fines tranches de cerveau, ce qui a donné lieu à des images d’astrocytes incomplets en raison de leurs grands domaines, limitant ainsi radicalement le nombre de cellules analysées. L’utilisation de la technique CLARITY permet de caractériser simultanément la résolution unicellulaire des populations cellulaires dans des volumes à grande échelle. L’imagerie de populations cellulaires marquées par fluorescence dans des cerveaux clairs n’offre pas de résolution synaptique, mais permet une caractérisation approfondie des interactions spatiales entre les astrocytes et une variété de types de cellules neuronales.
Pour cette raison, nous avons exploité ces techniques de pointe pour étudier les propriétés des astrocytes dans l’ensemble du CA1 dorsal, en imageant toutes les lames (Stratum Radiatum, couche pyramidale et Stratum Oriens). Nous avons mesuré des dizaines de milliers d’astrocytes (avec une pénétrance virale de >96%5), analysant ainsi l’information de l’ensemble de la population astrocytaire autour de CA1. Avec une pénétrance efficace des marqueurs neuronaux, nous avons pu enregistrer les interactions entre l’ensemble de la population d’astrocytes CA1 et les quatre types de cellules neuronales- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), neurones inhibiteurs VIP et cellules pyramidales excitatrices9.
Plusieurs expériences ont été réalisées en utilisant une combinaison de fluorescence d’animaux TG et de vecteurs viraux de couleurs différentes (toutes les cellules inhibitrices), tandis que d’autres (excitatrices) ont utilisé deux vecteurs viraux exprimant différents fluorophores sous différents promoteurs9. Cet article présente un protocole détaillé, y compris le marquage des cellules souhaitées dans le cerveau, rendant le cerveau transparent à l’aide d’une procédure CLARITY modifiée, ainsi que l’imagerie et l’analyse de structures cérébrales complètes, à l’aide de diverses procédures et logiciels.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

La combinaison de la transduction des vecteurs viraux et de l’élimination des tissus à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément plusieurs types de cellules cérébrales et leurs interactions. La transduction de vecteurs viraux permet le marquage de divers types de cellules dans différentes couleurs de fluorescence dans le même tissu. Les cellules peuvent être identifiées génétiquement par activité ou projection. En utilisant un protocole CLARITY modifié, la taille potentielle de l’échantillon d’astrocytes et de neurones a augmenté de 2 à 3 ordres de grandeur. L’utilisation de CLARITY permet l’imagerie d’astrocytes complets, qui sont trop gros pour tenir dans leur intégralité en tranches, et l’examen des somata avec tous leurs processus. En outre, il offre la possibilité d’étudier l’interaction spatiale entre les astrocytes et différents types de cellules neuronales, à savoir le nombre de neurones pyramidaux dans chaque domaine astrocytaire ou la proximité entre les astrocytes et des populations spécifiques de neurones inhibiteurs. Ce document décrit, en détail, comment ces méthodes doivent être appliquées.

Le nettoyage réussi des tranches épaisses de tissu cérébral entraîne une nouvelle gamme de questions qui peuvent être posées concernant les propriétés des grandes populations cellulaires par opposition aux propriétés des cellules individuelles ou des groupes de cellules voisines. Pour obtenir des résultats positifs, il faut respecter strictement le protocole CLARITY, car il existe un large éventail de paramètres qui doivent être pris en compte pour réduire la variance entre les échantillons (par exemple,...

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Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

La combinaison de la transduction du vecteur viral et de l’élimination du cerveau à l’aide de la méthode CLARITY permet d’étudier simultanément un grand nombre de neurones et d’astrocytes.

Étude de l’interaction spatiale entre les astrocytes et les neurones dans les cerveaux nettoyés

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

La technique de clarté décrite pour la première fois en 2013 est une technique de nettoyage des tissus qui permet d’échantillonner de plus grandes quantités de cellules, de vaisseaux sanguins, de sorte que même des protéines une résolution cellulaire unique dans des tranches de cerveau épaisses. Cette technique permet d’étudier des structures microscopiques intactes en rendant l’ensemble du cerveau transparent. Ce protocole est une puce simple et un pipeline direct pour les tissus clairs.Cette technique peut être utilisée pour nettoyer les tissus dans d’autres systèmes en plus des tissus cérébraux. Pour commencer, scellez le tube et le bouchon à l’aide d’un parafilm et perforez deux trous dans le bouchon. Ensuite, transférez l’azote gazeux du réservoir à l’aide d’un tuyau flexible de cinq millimètres de diamètre interne et d’une aiguille de calibre 19 connectée à son extrémité.Commencez le dégazage en fixant le tuyau au tube et en permettant l’échange de gaz pendant 30 minutes à température ambiante. Détachez le tuyau et scellez immédiatement les trous avec de la pâte à modeler. Ensuite, transférez les tubes scellés au dégazage dans un bain de 37 degrés Celsius pendant 3 heures et demie pour polymériser la solution d’hydrogel.Sortez le cerveau du tube. À l’aide de lingettes de laboratoire, retirez l’hydrogel polymérisé autour du cerveau en veillant à ce qu’aucun gel résiduel ne reste attaché à la surface du cerveau. Divisez le cerveau en tranches épaisses qui contiennent toutes les zones d’intérêt.Mettez les tranches dans la première solution de nettoyage et incubez à 37 degrés Celsius avec une rotation à 70 RPM pendant 24 heures. En attendant, préparez un tube perforé pour placer le cerveau. Placez le tube perforé dans un bécher rempli d’une deuxième solution de nettoyage sur un dispositif d’agitation.Ensuite, placez le cerveau dans le bécher et scellez-le avec du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment. Une fois que le tissu devient transparent, transférez le cerveau dans pbST en incubé à 37 degrés Celsius avec une rotation à 70 RPM pendant 24 heures. Remplacez la solution par du PBST frais et poursuivez l’incubation pendant encore 24 heures.Ensuite, transférez le cerveau au PBS à température ambiante pendant 24 heures. Après 24 heures, retirez le cerveau du PBS et transférez-le dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction. Incuber le cerveau à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Tout d’abord, placez l’échantillon au milieu de la diapositive. À l’aide de colle chaude, créez des murs sur les bords de la glissière, presque aussi hauts que le tissu. Assurez-vous de laisser un petit espace à l’un des coins.Lorsque la couche de colle chaude approche de la hauteur de la tranche cérébrale, appliquez une à deux gouttes de la solution correspondant à l’indice de réfraction sur l’échantillon pour humidifier la surface supérieure et empêcher la formation de bulles. Pendant que la colle chaude est encore liquide, scellez le dessus avec un couvercle, en le plaçant aussi uniformément que possible, puis remplissez la chambre avec la solution d’appariement de l’indice de réfraction. Comblez l’écart avec de la colle chaude.Si les parois de colle chaude s’étendent au-delà des bords de la glissière, coupez les bords d’extension. Si un objectif d’immersion dans l’huile est utilisé pour l’imagerie, ajoutez deux à trois millimètres de colle supplémentaires aux parois au-dessus du couvercle pour retenir la solution d’immersion. Après ce protocole, le tissu cérébral sera nettoyé.Des tranches de cerveau claires ont été préparées à l’aide de ce protocole pour visualiser les populations d’astrocytes et de neurones dans la région CA1 de l’hippocampe de la souris. Tous les astrocytes ont exprimé tdTomato et les neurones excitateurs ont exprimé H2B-GFP dans leurs noyaux. La chambre préparée pour le tissu clarifié était optimale pour l’imagerie sous un microscope à deux photons ou confocale.À l’aide d’un microscope à deux photons, plus de 300 astrocytes ont été observés dans une section dégagée de la région CA1 de l’hippocampe de la souris. Les astrocytes de l’hippocampe dans les cellules rouges et pyramidales, les somata en vert étaient des tissus visibles et épais et transparents représentant la proximité spatiale entre ces deux types de cellules. À l’aide d’un microscope confocal laser à balayage, des faisceaux axonaux de neurones excitateurs ont été tracés sur tout un hémisphère.Des faisceaux verts ont été tracés de l’hippocampe dorsal vers les corps super mamillaires. Les faisceaux rouges ont été tracés à partir des corps mamillaires jusqu’à leur origine à l’hippocampe d’évent. Des facteurs tels que la température, les concentrations et le temps d’incubation ont influencé le résultat de la procédure de clarté.Par conséquent, la précision à chaque étape du protocole est vitale pour le succès de l’obtention de tissus clairs. En utilisant cette technique, nous mesurons les distances entre les neurones et les astrocytes dans plusieurs structures cérébrales. Ce protocole a permis d’analyser deux à trois ordres de grandeur de plus de cellules que dans les études précédentes.

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