Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Grant Agreement No 803589), der Israel Science Foundation (ISF-Grant Nr. 1815/18) und der Canada-Israel Grants (CIHR-ISF, Grant No. 2591/18) gefördert. Wir danken Nechama Novick für den Kommentar zum gesamten Manuskript.

Die Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der Hebrew University genehmigt und entsprachen den Richtlinien des National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virale Vektortransduktion
HINWEIS: Virale Vektortransduktion wird verwendet, um Fluorophore im Gehirn zu exprimieren.
<ol><li>Verwenden Sie einen Atlas (z. B. Allen Brain Atlas), um die relevante Koordination des Zielbereichs zu lokalisi...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Gewebe-Clearing-Methoden stellen ein revolutionäres Werkzeug in der Hirnforschung dar und laden zu Fragen ein, die bisher nicht hätten gestellt werden können. CLARITY zielt nicht mehr auf die Eigenschaften einer kleinen Gruppe von Zellen, einer einzelnen Zelle oder sogar einer einzelnen Synapse ab und ermöglicht nun das Targeting von Gesamtzellpopulationen oder langreichweitigen Konnektivitätsmerkmalen durch die Verwendung relevanter Fluorophore.
Das Ergebnis der Kombination aus Fluoropho...

In den letzten Jahren hat das Wissen über die Funktion von Astrozyten und wie sie mit neuronalen Schaltkreisen interagieren, dramatisch zugenommen. Astrozyten können die Plastizität beeinflussen 1,2, die neuronale Erholung nach einer Verletzungunterstützen 3,4 und sogar eine de novo neuronale Potenzierung induzieren, wobei neuere Studien die Bedeutung von Astrozyten für den Gedächtniserwerb und die Belohnung zeigen, die bisher als rein neuronale Funktionen angesehen wurden 5,6,7 . Ein Merkmal von besonderem Interesse in der Astrozytenforschung ist die räumliche Anordnung der Zellen, die einzigartige räumliche Organisationen im Hippocampus und anderen Gehirnstrukturen aufrechterhalten 8,9,10. Im Gegensatz zu den neuronalen Dendriten, die sich zwischen den Zellsomata verflechten, bewohnen Hippocampus-Astrozyten visuell unterscheidbare Territorien mit leichten Überlappungen zwischen ihren Prozessen, wodurch unterschiedliche Domänenentstehen 8,11,12,13. Die Beweise, die die Teilnahme von Astrozyten an neuronalen Schaltkreisen unterstützen, unterstützen nicht das Fehlen einer detaillierten anatomischen Beschreibung solcher Populationen und der Neuronen in ihren Domänen14.
Virale Vektortransduktionsverfahren wurden zusammen mit transgenen Tieren (TG) als Werkzeugset zur Untersuchung von Gehirnstrukturen, -funktionen und Zellinteraktionenpopulär gemacht 15,16. Die Verwendung verschiedener Promotoren ermöglicht das Targeting spezifischer Zellen entsprechend ihren genetischen Eigenschaften, Aktivierungsstufen17,18 oder Projektionszielen. Verschiedene Viren können in verschiedenen Populationen verschiedenfarbige Fluorophore exprimieren. Ein Virus kann mit der endogenen Expression von Fluorophoren in TG kombiniert werden, oder TG-Tiere können ohne Viren verwendet werden. Diese Techniken werden häufig für die neuronale Markierung verwendet, und einige Labore haben begonnen, sie mit Modifikationen zu verwenden, die auf andere Zelltypen wie Astrozyten 5,9,19 spezialisiert sind.
Die CLARITY-Technik, die erstmals 2013 20,21 beschrieben wurde, ermöglicht die Untersuchung dicker Hirnschnitte, indem sie das gesamte Gehirn transparent macht und gleichzeitig die mikroskopischen Strukturen intakt lässt. Durch die Kombination der beiden Methoden - virale Vektortransduktion und Gewebereinigung - steht nun die Möglichkeit zur Verfügung, die räumlichen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltyppopulationen zu untersuchen. Die meisten Astrozyten-Neuronen-Interaktionsstudien wurden an dünnen Gehirnschnitten durchgeführt, was zu Bildern unvollständiger Astrozyten aufgrund ihrer großen Domänen führte, wodurch die Anzahl der analysierten Zellen radikal eingeschränkt wurde. Die Verwendung der CLARITY-Technik ermöglicht die gleichzeitige Charakterisierung von Zellpopulationen in großflächigen Volumina mit Einzelzellauflösung. Die Abbildung fluoreszierend markierter Zellpopulationen in klaren Gehirnen liefert keine synaptische Auflösung, sondern ermöglicht eine gründliche Charakterisierung der räumlichen Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und einer Vielzahl von neuronalen Zelltypen.
Aus diesem Grund nutzten wir diese hochmodernen Techniken, um die Eigenschaften von Astrozyten im gesamten dorsalen CA1 zu untersuchen und alle Lamina (Stratum Radiatum, Pyramidenschicht und Stratum Oriens) abzubilden. Wir haben Zehntausende von Astrozyten (mit einer Viruspenetranz von >96%5) gemessen und dabei die Informationen der gesamten astrozytischen Population um CA1 analysiert. Mit effizienter Penetranz der neuronalen Marker konnten wir die Wechselwirkungen zwischen der gesamten Population von CA1-Astrozyten und den vier Arten von neuronalen Zellen - Parvalbumin (PV), Somatostatin (SST), VIP-hemmenden Neuronen und exzitatorischen Pyramidenzellen9 - aufzeichnen.
Mehrere Experimente wurden mit einer Kombination aus Fluoreszenz von TG-Tieren und verschiedenfarbigen viralen Vektoren (alle inhibitorischen Zellen) durchgeführt, während andere (exzitatorisch) zwei virale Vektoren verwendeten, die verschiedene Fluorophore unter verschiedenen Promotoren exprimierten9. Dieses Papier stellt ein detailliertes Protokoll vor, einschließlich der Markierung der gewünschten Zellen im Gehirn, der Transparentmachung des Gehirns mit einem modifizierten CLARITY-Verfahren sowie der Bildgebung und Analyse kompletter Gehirnstrukturen mit verschiedenen Verfahren und Software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gewebereinigung mit der CLARITY-Methode ermöglicht es, mehrere Arten von Gehirnzellen und deren Wechselwirkungen gleichzeitig zu untersuchen. Die virale Vektortransduktion ermöglicht die Markierung verschiedener Zelltypen in verschiedenen Fluoreszenzfarben innerhalb desselben Gewebes. Zellen können genetisch durch Aktivität oder Projektion identifiziert werden. Unter Verwendung eines modifizierten CLARITY-Protokolls ist die potenzielle Stichprobengröße von Astrozyten und Neuronen um 2-3 Größenordnungen gewachsen. Der Einsatz von CLARITY ermöglicht die Abbildung kompletter Astrozyten, die zu groß sind, um in ihrer Gesamtheit in Scheiben zu passen, und die Untersuchung der Somata mit all ihren Prozessen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, die räumliche Interaktion zwischen Astrozyten und verschiedenen neuronalen Zelltypen zu untersuchen, nämlich die Anzahl der pyramidenförmigen Neuronen in jeder astrozytischen Domäne oder die Nähe zwischen Astrozyten und spezifischen inhibitorischen Neuronenpopulationen. In diesem Beitrag wird ausführlich beschrieben, wie diese Methoden anzuwenden sind.

Die erfolgreiche Beseitigung dicker Hirngewebeschnitte führt zu einer neuen Reihe von Fragen, die in Bezug auf die Eigenschaften von großzelligen Populationen im Gegensatz zu den Eigenschaften einzelner Zellen oder benachbarter Zellgruppen gestellt werden können. Um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen, sollte man sich strikt an das CLARITY-Protokoll halten, da es eine Vielzahl von Parametern gibt, die berücksichtigt werden müssen, um die Varianz zwischen den Proben zu reduzieren (z. B. Prozentsatz der Klarheit, Fluo...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gehirn-Clearing mit der CLARITY-Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl von Neuronen und Astrozyten.

Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Die Klarheitstechnik, die erstmals 2013 beschrieben wurde, ist eine Gewebereinigungstechnik, die die Probenahme größerer Mengen von Zellen, Blutgefäßen, also sogar Proteinen einer solchen Einzelzellauflösung in dicken Gehirnscheiben ermöglicht. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung intakter mikroskopischer Strukturen, indem sie das gesamte Gehirn transparent macht. Dieses Protokoll ist ein einfacher Chip und eine unkomplizierte Pipeline für Tissue Clear.Diese Technik kann zur Reinigung von Geweben in anderen Systemen zusätzlich zu Gehirngewebe verwendet werden. Um zu beginnen, verschließen Sie das Rohr und die Kappe mit Parafilm und durchstechen Sie zwei Löcher in die Kappe. Übertragen Sie dann Stickstoffgas aus dem Tank mit einem flexiblen Rohr mit einem Innendurchmesser von fünf Millimetern und einer 19-Gauge-Nadel, die an seinem Ende angeschlossen ist.Beginnen Sie mit der Entgasung, indem Sie das Rohr am Rohr befestigen und den Gasaustausch für 30 Minuten bei Raumtemperatur ermöglichen. Lösen Sie das Rohr und schließen Sie die Löcher sofort mit Modelliermasse ab. Dann die entgasungsversiegelten Röhrchen für 3 1/2 Stunden in ein 37 Grad Celsius-Bad geben, um die Hydrogellösung zu polymerisieren.Nimm das Gehirn aus der Röhre heraus. Entfernen Sie mit Labortüchern das polymerisierte Hydrogel um das Gehirn herum, um sicherzustellen, dass kein Restgel an der Oberfläche des Gehirns haftet. Teilen Sie das Gehirn in dicke Scheiben, die alle Bereiche von Interesse enthalten.Legen Sie die Scheiben in die erste Räumlösung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit Rotation bei 70 U / min für 24 Stunden. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen perforierten Schlauch vor, um das Gehirn zu platzieren. Legen Sie das perforierte Rohr in ein mit zweiter Räumlösung gefülltes Becherglas auf eine Rührvorrichtung.Legen Sie dann das Gehirn in das Becherglas und versiegeln Sie es mit Aluminiumfolie, um ein Bleichen zu verhindern. Nachdem das Gewebe transparent geworden ist, übertragen Sie das Gehirn in PBST und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit einer Rotation bei 70 U / min für 24 Stunden. Ersetzen Sie die Lösung durch frisches PBST und setzen Sie die Inkubation für weitere 24 Stunden fort.Übertragen Sie dann das Gehirn 24 Stunden lang bei Raumtemperatur auf PBS. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Gehirn von PBS und übertragen Sie es auf die Brechungsindex-Matching-Lösung. Inkubieren Sie das Gehirn bei 37 Grad Celsius über Nacht.Platzieren Sie die Probe zunächst in der Mitte des Objektträgers. Erstellen Sie mit Heißkleber Wände an den Rändern des Objektträgers, die fast so hoch sind wie das Gewebe. Achten Sie darauf, eine kleine Lücke an einer der Ecken zu lassen.Wenn sich die Heißklebeschicht der Höhe der Gehirnscheibe nähert, tragen Sie ein bis zwei Tropfen der Brechungsindex-Matching-Lösung auf die Probe auf, um die obere Oberfläche zu befeuchten und die Bildung von Blasen zu verhindern. Während der Heißkleber noch flüssig ist, verschließen Sie die Oberseite mit einem Deckschlitten, legen Sie sie so gleichmäßig wie möglich und füllen Sie dann die Kammer mit der Brechungsindex-Matching-Lösung. Schließen Sie die Lücke mit Heißkleber.Wenn die Heißklebewände über die Ränder des Objektträgers hinausragen, schneiden Sie die ausladenden Kanten ab. Wenn ein Öltauchobjektiv für die Bildgebung verwendet wird, fügen Sie weitere zwei bis drei Millimeter Kleber an die Wände über dem Deckglas hinzu, um die Tauchlösung zu erhalten. Nach diesem Protokoll wird das Hirngewebe gereinigt.Mit diesem Protokoll wurden klare Gehirnschnitte hergestellt, um Populationen von Astrozyten und Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus der Maus zu visualisieren. Alle Astrozyten exprimierten tdTomaten und exzitatorische Neuronen exprimierten H2B-GFP in ihren Kernen. Die für das geklärte Gewebe vorbereitete Kammer war optimal für die Bildgebung unter einem Zwei-Photonen- oder Konfokalmikroskop.Mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop wurden über 300 Astrozyten in einem geräumten Abschnitt der CA1-Region des Hippocampus der Maus beobachtet. Die Hippocampus-Astrozyten in roten und pyramidalen Zellen, Somata in Grün waren sichtbares und dickes, transparentes Gewebe, das die räumliche Nähe zwischen diesen beiden Zelltypen darstellte. Mit einem konfokalen Rasterlasermikroskop wurden axonale Bündel von exzitatorischen Neuronen über eine ganze Hemisphäre verfolgt.Grüne Bündel wurden vom dorsalen Hippocampus in Richtung der Supermamillarkörper verfolgt. Die roten Bündel wurden von den Brustkörpern bis zu ihrem Ursprung am Hippocampus der Entlüftung verfolgt. Faktoren wie Temperatur, Konzentrationen und Inkubationszeit beeinflussten das Ergebnis des Klarheitsverfahrens.Daher ist die Präzision in jedem Schritt des Protokolls entscheidend für den Erfolg, klares Gewebe zu erreichen. Mit dieser Technik messen wir die Abstände zwischen Neuronen und Astrozyten in mehreren Gehirnstrukturen. Dieses Protokoll ermöglichte die Analyse von zwei bis drei Größenordnungen mehr Zellen als in früheren Studien.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

Tactile Conditioning und Bewegungsanalyse der antennalen Sampling Strategies In Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...