Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 803589), מהקרן הישראלית למדע (מענק ISF מס' 1815/18) ומענקי קנדה-ישראל (CIHR-ISF, מענק מס' 2591/18). אנו מודים לנחמה נוביק על ההערה על כתב היד כולו.

פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה העברית ועמדו בהנחיות המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן.
1. התמרה וקטורית ויראלית
הערה: התמרה וקטורית נגיפית משמשת לביטוי פלואורופורים במוח.
<ol><li>השת?...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

שיטות לניקוי רקמות מהוות כלי מהפכני בחקר המוח, ומזמינות שאלות שלא ניתן היה לשאול קודם לכן. מהתמקדות בתכונות של קבוצה קטנה של תאים, תא בודד או אפילו סינפסה בודדת, CLARITY מאפשרת כעת מיקוד של אוכלוסיות תאים כוללות או תכונות קישוריות ארוכות טווח באמצעות פלואורופורים רלוונטיים.
הת?...

בשנים האחרונות, הידע על תפקוד האסטרוציטים וכיצד הם מתקשרים עם מעגלים עצביים גדל באופן דרמטי. אסטרוציטים יכולים להשפיע על פלסטיות 1,2, לסייע בהתאוששות עצבית לאחר הלידה 3,4, ואפילו לגרום לפוטנציה עצבית דה נובו, כאשר מחקרים אחרונים מראים את החשיבות של אסטרוציטים ברכישה ותגמול של זיכרון, שנחשבו בעבר לתפקודים עצביים גרידא 5,6,7 . מאפיין שמעניין במיוחד בחקר האסטרוציטים הוא הסידור המרחבי של התאים, השומרים על ארגונים מרחביים ייחודיים בהיפוקמפוס ובמבני מוח אחרים 8,9,10. שלא כמו הדנדריטים העצביים המשתלבים בין סומטה של התאים, אסטרוציטים בהיפוקמפוס מאכלסים טריטוריות הניתנות להבחנה חזותית עם חפיפה קלה בין התהליכים שלהם, ויוצרים תחומים נפרדים 8,11,12,13. הראיות התומכות בהשתתפותם של אסטרוציטים במעגלים עצביים אינן תומכות בהיעדר תיאור אנטומי מפורט של אוכלוסיות כאלה ושל תאי העצב בתחומם14.
הליכי התמרה וקטורית נגיפית, יחד עם בעלי חיים מהונדסים (TG), זכו לפופולריות כמערכת כלים לחקר מבנים מוחיים, תפקודים ואינטראקציות בין תאים15,16. השימוש במקדמים שונים מאפשר מיקוד של תאים ספציפיים על פי תכונותיהם הגנטיות, רמות ההפעלה17,18 או יעדי ההקרנה שלהם. וירוסים שונים יכולים לבטא פלואורופורים בצבעים שונים באוכלוסיות שונות. ניתן לשלב נגיף עם ביטוי אנדוגני של פלואורופורים ב- TG, או שניתן להשתמש בחיות TG ללא צורך בנגיפים. טכניקות אלה נמצאות בשימוש נרחב לסימון עצבי, וכמה מעבדות החלו להשתמש בהן עם שינויים המתמחים בהתמקדות בסוגי תאים אחרים, כגון אסטרוציטים 5,9,19.
טכניקת CLARITY, שתוארה לראשונה בשנת 2013 20,21, מאפשרת לחקור פרוסות מוח עבות על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף תוך השארת המבנים המיקרוסקופיים שלמים. על ידי שילוב שתי השיטות - התמרה וקטורית נגיפית וניקוי רקמות - האפשרות לבחון את האינטראקציות המרחביות בין אוכלוסיות שונות של סוגי תאים זמינה כעת. רוב מחקרי האינטראקציה בין אסטרוציטים לנוירונים בוצעו על פרוסות מוח דקות, וכתוצאה מכך תמונות של אסטרוציטים לא שלמים בשל תחומיהם הגדולים, ובכך הגבילו באופן קיצוני את מספר התאים שנותחו. השימוש בטכניקת CLARITY מאפשר אפיון ברזולוציה של תא יחיד של אוכלוסיות תאים בכמויות גדולות בו-זמנית. הדמיה של אוכלוסיות תאים המתויגות באופן פלואורסצנטי במוחות צלולים אינה מספקת רזולוציה סינפטית, אלא מאפשרת אפיון יסודי של האינטראקציות המרחביות בין אסטרוציטים למגוון סוגי תאים עצביים.
מסיבה זו, רתמנו את הטכניקות המתקדמות האלה כדי לחקור את התכונות של אסטרוציטים לאורך CA1 הגבי, תוך הדמיה של כל הלמינה (Stratum Radiatum, שכבת הפירמידה ו-Stratum Oriens). מדדנו עשרות אלפי אסטרוציטים (עם חדירה נגיפית של >96%5), ובכך ניתחנו את המידע של כל האוכלוסייה האסטרוציטית סביב CA1. בעזרת חדירה יעילה של הסמנים העצביים, נוכל לתעד את האינטראקציות בין כל האוכלוסייה של אסטרוציטים CA1 לבין ארבעת הסוגים של תאים עצביים-פרוואלבומין (PV), סומטוסטטין (SST), נוירונים מעכבי VIP ותאים פירמידליים מעוררים9.
מספר ניסויים בוצעו באמצעות שילוב של פלואורסצנציה מחיות TG וווקטורים נגיפיים בצבעים שונים (כולם תאים מעכבים), בעוד שאחרים (מעוררים) השתמשו בשני וקטורים ויראליים המבטאים פלואורופורים שונים תחת מקדמים שונים9. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט, הכולל תיוג של התאים הרצויים במוח, מה שהופך את המוח לשקוף באמצעות הליך CLARITY שונה, כמו גם הדמיה וניתוח של מבנים מוחיים שלמים, באמצעות נהלים ותוכנות שונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

שילוב של התמרה וקטורית נגיפית ופינוי רקמות בשיטת CLARITY מאפשר לחקור בו-זמנית מספר סוגים של תאי מוח ואת האינטראקציות ביניהם. התמרה וקטורית נגיפית מאפשרת סימון של סוגי תאים מגוונים בצבעים פלואורסצנטיים שונים בתוך אותה רקמה. ניתן לזהות תאים מבחינה גנטית על ידי פעילות או הקרנה. באמצעות פרוטוקול CLARITY שונה, גודל המדגם הפוטנציאלי של אסטרוציטים ותאי עצב גדל ב-2-3 סדרי גודל. השימוש ב- CLARITY מאפשר הדמיה של אסטרוציטים שלמים, שהם גדולים מכדי להתאים לשלמותם בפרוסות, ובדיקת הסומטה עם כל התהליכים שלהם. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות לחקור את האינטראקציה המרחבית בין אסטרוציטים לסוגי תאים עצביים שונים, כלומר, מספר הנוירונים הפירמידליים בכל תחום אסטרוציטי או הקרבה בין אסטרוציטים לאוכלוסיות נוירונים מעכבות ספציפיות. מאמר זה מתאר, בפירוט, כיצד יש ליישם שיטות אלה.

ניקוי מוצלח של פרוסות רקמת מוח עבות מביא למגוון חדש של שאלות שניתן לשאול לגבי התכונות של אוכלוסיות תאים גדולות, בניגוד לתכונות של תאים בודדים או קבוצות תאים שכנות. כדי להשיג תוצאות מוצלחות, יש להקפיד על פרוטוקול CLARITY, שכן יש מגוון רחב של פרמטרים שיש לקחת בחשבון כדי להפחית את השונות בין הדגי?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

טכניקת הבהירות שתוארה לראשונה בשנת 2013 היא טכניקת ניקוי רקמות המאפשרת דגימות של כמויות גדולות יותר של תאים, כלי דם, כך שאפילו חלבונים כאלה ברזולוציה של תא בודד בפרוסות מוח עבות. טכניקה זו מאפשרת לחקור מבנים מיקרוסקופיים שלמים על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף. פרוטוקול זה הוא שבב פשוט וצינור פשוט עבור רקמות ברורות.טכניקה זו יכולה לשמש לפינוי רקמות במערכות אחרות בנוסף לרקמות המוח. כדי להתחיל, אטמו את הצינור ואת המכסה באמצעות פרפילם ונקבו שני חורים בכובע. לאחר מכן להעביר גז חנקן מהמיכל באמצעות צינור גמיש עם קוטר פנימי של חמישה מילימטרים ומחט של 19 מד המחוברת בקצהו.התחילו לגזע על ידי חיבור הצינור לצינור ואפשרו חילופי גזים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נתקו את הצינור ומיד אטמו את החורים בחימר דוגמנות. לאחר מכן מעבירים את הצינורות האטומים של דגה לאמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 1/2 שעות כדי לפלמל את תמיסת ההידרוג'ל.הוציאו את המוח מהצינור. באמצעות מגבוני מעבדה, הסר את ההידרוג'ל הפולימרי סביב המוח כדי להבטיח שלא יישארו שאריות ג'ל מחוברות לפני השטח של המוח. חלקו את המוח לפרוסות עבות המכילות את כל תחומי העניין.מכניסים את הפרוסות לתמיסת הניקוי הראשונה ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. בינתיים, הכינו צינור מחורר כדי למקם את המוח. שים את הצינור המחורר בכוס מלאה בתמיסת ניקוי שנייה במכשיר ערבוב.לאחר מכן הניחו את המוח בכוס ואטמו אותו בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה. לאחר שהרקמה הופכת שקופה, העבירו את המוח ל-PBST באינקובציה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. החליפו את התמיסה ב-PBST טרי והמשיכו את הדגירה עוד 24 שעות.לאחר מכן העבירו את המוח ל-PBS בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הסר את המוח מ- PBS והעבר אותו לתמיסת התאמת מקדם שבירה. הדגירה של המוח ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.ראשית, מקם את הדגימה באמצע השקופית. באמצעות דבק חם, ליצור קירות בשולי המגלשה, כמעט כמו הרקמה. הקפידו להשאיר פער קטן באחת הפינות.כאשר שכבת הדבק החם מתקרבת לגובה פרוסת המוח, יש למרוח אחת עד שתי טיפות של תמיסת התאמת מקדם השבירה על הדגימה כדי להרטיב את המשטח העליון ולמנוע היווצרות בועות. בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי, אטמו את החלקה העליונה בהחלקת כיסוי, הניחו אותו באופן שווה ככל האפשר ואז מלאו את התא בתמיסת ההתאמה של מקדם השבירה. סגרו את הפער בדבק חם.אם דפנות הדבק החם משתרעות מעבר לגבולות המגלשה, חתכו את הקצוות המתרחבים. אם מטרת טבילת שמן משמשת להדמיה, הוסיפו עוד שניים עד שלושה מילימטרים של דבק לקירות שמעל החלקת הכיסוי כדי לשמור על תמיסת הטבילה. לאחר פרוטוקול זה, רקמת המוח תפונה.פרוסות מוח ברורות הוכנו באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין אוכלוסיות של אסטרוציטים ותאי עצב באזור CA1 של היפוקמפוס עכבר. כל האסטרוציטים ביטאו tdTomato ותאי עצב מעוררים ביטאו H2B-GFP בגרעינים שלהם. התא שהוכן עבור הרקמה המובהקת היה אופטימלי להדמיה תחת שני פוטון או מיקרוסקופ קונפוקלי.באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים, נצפו יותר מ-300 אסטרוציטים בקטע מנוקה של אזור CA1 של היפוקמפוס העכבר. האסטרוציטים ההיפוקמפוסים בתאים אדומים ופירמידאליים, סומטה בירוק היו גלויים ועבים, רקמה שקופה המייצגת את הקרבה המרחבית בין שני סוגי התאים הללו. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר סורק, צרורות אקסונאליים מתאי עצב מעוררים אותרו על פני חצי כדור שלם.צרורות ירוקים אותרו מההיפוקמפוס הגבי לעבר הגופות הסופר-מימיות. הצרורים האדומים אותרו מגופי המאמילרים לעבר מקורם בהיפוקמפוס האוורור. גורמים, כגון טמפרטורה, ריכוזים וזמן דגירה השפיעו על תוצאות הליך הבהירות.לכן, הדיוק בכל שלב של הפרוטוקול חיוני להצלחת השגת רקמה ברורה. באמצעות טכניקה זו, אנו מודדים את המרחקים בין נוירונים לאסטרוציטים בכמה מבני מוח. פרוטוקול זה איפשר ניתוח של שניים עד שלושה סדרי גודל של יותר תאים מאשר במחקרים קודמים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

מיזוג מישוש וניתוח תנועה של אסטרטגיות דגימת מחושים בדבורי דבש (<em&gt; תפיס mellifera</em&gt; ל &#39;)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...