Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता नहीं 803589), इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ अनुदान संख्या 1815/18), और कनाडा-इज़राइल अनुदान (CIHR-ISF, अनुदान संख्या 2591/18) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC) से धन प्राप्त हुआ है। हम पूरी पांडुलिपि पर टिप्पणी करने के लिए Nechama Novick धन्यवाद.

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल हिब्रू विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य गाइड संस्थान के दिशानिर्देशों क?...

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	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

ऊतक समाशोधन विधियां मस्तिष्क अनुसंधान में एक क्रांतिकारी उपकरण प्रस्तुत करती हैं, जो उन प्रश्नों को आमंत्रित करती हैं जो पहले नहीं पूछे जा सकते थे। कोशिकाओं के एक छोटे समूह, एक एकल सेल, या यहां तक कि एक ?...

हाल के वर्षों में, एस्ट्रोसाइट फ़ंक्शन का ज्ञान और वे न्यूरोनल सर्किट के साथ कैसे बातचीत करते हैं, नाटकीय रूप से बढ़ गया है। एस्ट्रोसाइट्स प्लास्टिसिटी 1,2 को प्रभावित कर सकते हैं, न्यूरोनल पोस्टइंजरी रिकवरी 3,4 में सहायता कर सकते हैं, और यहां तक कि डे नोवो न्यूरोनल potentiation को प्रेरित कर सकते हैं, हाल के अध्ययनों में स्मृति अधिग्रहण और इनाम में एस्ट्रोसाइट्स के महत्व को प्रदर्शित किया गया है, जिसे पहले विशुद्ध रूप से न्यूरोनल कार्यों के रूप में माना जाता है 5,6,7 . एस्ट्रोसाइट अनुसंधान में विशेष रुचि की एक विशेषता कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था है, जो हिप्पोकैम्पस और अन्य मस्तिष्क संरचनाओं में अद्वितीय स्थानिक संगठनों को बनाए रखतीहै 8,9,10। न्यूरोनल डेंड्राइट्स के विपरीत जो सेल सोमाटा के बीच इंटरटॉइन करते हैं, हिप्पोकैम्पल एस्ट्रोसाइट्स अपनी प्रक्रियाओं के बीच मामूली ओवरलैप के साथ नेत्रहीन रूप से अलग-अलग क्षेत्रों में निवास करते हैं, जिससे अलग-अलग डोमेन 8,11,12,13 बनते हैं। न्यूरोनल सर्किट में एस्ट्रोसाइट्स की भागीदारी का समर्थन करने वाले सबूत इस तरह की आबादी और उनके डोमेन में न्यूरॉन्स के विस्तृत शारीरिक विवरण की कमी का समर्थन नहीं करतेहैं।
वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं, ट्रांसजेनिक जानवरों (टीजी) के साथ, मस्तिष्क संरचनाओं, कार्यों और सेल इंटरैक्शन15,16 की जांच करने के लिए एक टूलसेट के रूप में लोकप्रिय किया गया है। विभिन्न प्रवर्तकों का उपयोग उनके आनुवंशिक गुणों, सक्रियण स्तर17,18, या प्रक्षेपण लक्ष्यों के अनुसार विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देता है। विभिन्न वायरस विभिन्न आबादी में अलग-अलग रंगीन फ्लोरोफोरस व्यक्त कर सकते हैं। एक वायरस को टीजी में फ्लोरोफोरस की अंतर्जात अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है, या टीजी जानवरों का उपयोग वायरस की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है। इन तकनीकों का व्यापक रूप से न्यूरोनल अंकन के लिए उपयोग किया जाता है, और कुछ प्रयोगशालाओं ने अन्य सेल प्रकारों को लक्षित करने के लिए विशेष संशोधनों के साथ उनका उपयोग करना शुरू कर दिया है, जैसे एस्ट्रोसाइट्स 5,9,19।
स्पष्टता तकनीक, पहली बार 201320,21 में वर्णित, माइक्रोस्कोपिक संरचनाओं को बरकरार रखते हुए पूरे मस्तिष्क को पारदर्शी बनाकर मोटे मस्तिष्क स्लाइस के अध्ययन को सक्षम बनाती है। दो तरीकों-वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और ऊतक समाशोधन के संयोजन से- विभिन्न सेल प्रकार की आबादी के बीच स्थानिक बातचीत की जांच करने का विकल्प अब उपलब्ध है। अधिकांश एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन अध्ययन पतले मस्तिष्क स्लाइस पर किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप उनके बड़े डोमेन के कारण अपूर्ण एस्ट्रोसाइट्स की छवियां होती हैं, इस प्रकार विश्लेषण की गई कोशिकाओं की संख्या को मौलिक रूप से प्रतिबंधित किया जाता है। CLARITY तकनीक का उपयोग एक साथ बड़े पैमाने पर वॉल्यूम में सेल आबादी के एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। स्पष्ट दिमाग में इमेजिंग फ्लोरोसेंटली टैग की गई सेल आबादी सिनैप्टिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं करती है, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स और विभिन्न प्रकार के न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच स्थानिक इंटरैक्शन के पूरी तरह से लक्षण वर्णन की अनुमति देती है।
इस कारण से, हमने पृष्ठीय CA1 में एस्ट्रोसाइट्स के गुणों की जांच करने के लिए इन अत्याधुनिक तकनीकों का उपयोग किया, सभी लामिना (स्ट्रैटम रेडिएटम, पिरामिडल लेयर और स्ट्रैटम ओरियन्स) को इमेजिंग किया। हमने हजारों एस्ट्रोसाइट्स (>96%5 के वायरल पेनेट्रेंस के साथ) को मापा, जिससे सीए 1 के आसपास की पूरी एस्ट्रोसाइटिक आबादी की जानकारी का विश्लेषण किया जा सके। न्यूरोनल मार्करों के कुशल पेनेट्रेंस के साथ, हम सीए 1 एस्ट्रोसाइट्स की पूरी आबादी और चार प्रकार के न्यूरोनल कोशिकाओं-परवलब्यूमिन (पीवी), सोमाटोस्टेटिन (एसएसटी), वीआईपी निरोधात्मक न्यूरॉन्स और उत्तेजक पिरामिड कोशिकाओं के बीच बातचीत को रिकॉर्ड कर सकतेहैं।
टीजी जानवरों और अलग-अलग रंगीन वायरल वैक्टर (सभी निरोधात्मक कोशिकाओं) से प्रतिदीप्ति के संयोजन का उपयोग करके कई प्रयोग किए गए थे, जबकि अन्य (उत्तेजक) ने विभिन्न प्रमोटरों के तहत अलग-अलग फ्लोरोफोर को व्यक्त करने वाले दो वायरल वैक्टरका उपयोग किया था। यह पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें मस्तिष्क में वांछित कोशिकाओं की टैगिंग शामिल है, जो मस्तिष्क को एक संशोधित स्पष्टता प्रक्रिया का उपयोग करके पारदर्शी बनाती है, साथ ही साथ विभिन्न प्रक्रियाओं और सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पूर्ण मस्तिष्क संरचनाओं की इमेजिंग और विश्लेषण करती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

CLARITY विधि का उपयोग करके वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और ऊतक समाशोधन के संयोजन से मस्तिष्क कोशिकाओं के कई प्रकार और उनकी बातचीत की एक साथ जांच करना संभव हो जाता है। वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन एक ही ऊतक के भीतर विभिन्न प्रतिदीप्ति रंगों में विभिन्न सेल प्रकारों के अंकन को सक्षम बनाता है। कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से गतिविधि या प्रक्षेपण द्वारा पहचाना जा सकता है। एक संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स का संभावित नमूना आकार परिमाण के 2-3 आदेशों से बढ़ गया है। स्पष्टता का उपयोग पूर्ण एस्ट्रोसाइट्स की इमेजिंग की अनुमति देता है, जो स्लाइस में अपनी संपूर्णता में फिट होने के लिए बहुत बड़े हैं, और उनकी सभी प्रक्रियाओं के साथ सोमाटा की परीक्षा। इसके अलावा, यह एस्ट्रोसाइट्स और विभिन्न न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच स्थानिक बातचीत की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, अर्थात्, प्रत्येक एस्ट्रोसाइटिक डोमेन में पिरामिड न्यूरॉन्स की संख्या या एस्ट्रोसाइट्स और विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन आबादी के बीच निकटता। यह पेपर विस्तार से वर्णन करता है कि इन विधियों को कैसे लागू किया जाना है।

मोटी मस्तिष्क ऊतक स्लाइस के सफल समाशोधन के परिणामस्वरूप प्रश्नों की एक नई श्रृंखला होती है जो एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के पड़ोसी समूहों के गुणों के विपरीत बड़ी कोशिका आबादी के गुणों के बारे में पूछे ज...

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Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

CLARITY विधि का उपयोग करके वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और मस्तिष्क समाशोधन के संयोजन से बड़ी संख्या में न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की जांच एक साथ हो सकती है।

साफ दिमाग में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच स्थानिक बातचीत की जांच

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

2013 में पहली बार वर्णित स्पष्टता तकनीक एक ऊतक समाशोधन तकनीक है जो कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं की बड़ी मात्रा के नमूने को सक्षम बनाती है, इसलिए यहां तक कि मोटे मस्तिष्क स्लाइस में इस तरह के एकल सेल रिज़ॉल्यूशन प्रोटीन भी। यह तकनीक पूरे मस्तिष्क को पारदर्शी बनाकर बरकरार सूक्ष्म संरचनाओं के अध्ययन को सक्षम बनाती है। यह प्रोटोकॉल ऊतक स्पष्ट के लिए एक सरल चिप और सीधी पाइपलाइन है।इस तकनीक का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों के अलावा अन्य प्रणालियों में ऊतकों को साफ करने के लिए किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, पैराफिल्म का उपयोग करके ट्यूब और कैप को सील करें और कैप में दो छेद पंचर करें। फिर पांच मिलीमीटर आंतरिक व्यास और इसके अंत में जुड़े 19 गेज सुई के साथ एक लचीले पाइप का उपयोग करके टैंक से नाइट्रोजन गैस को स्थानांतरित करें।ट्यूब के लिए पाइप संलग्न करने और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गैस विनिमय की अनुमति देकर degassing शुरू करें। पाइप को अलग करें और तुरंत मॉडलिंग मिट्टी के साथ छेद को सील करें। फिर हाइड्रोजेल समाधान को पॉलिमराइज़ करने के लिए 3 1/2 घंटे के लिए डेगास सील किए गए ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में स्थानांतरित करें।मस्तिष्क को ट्यूब से बाहर निकालें। प्रयोगशाला वाइप्स का उपयोग करके, मस्तिष्क के चारों ओर पॉलिमराइज्ड हाइड्रोजेल को हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि मस्तिष्क की सतह से कोई अवशिष्ट जेल जुड़ा नहीं रहता है। मस्तिष्क को मोटे स्लाइस में विभाजित करें जिसमें ब्याज के सभी क्षेत्र होते हैं।पहले समाशोधन समाधान में स्लाइस रखो और 24 घंटे के लिए 70 आरपीएम पर रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इस बीच, मस्तिष्क को रखने के लिए एक छिद्रित ट्यूब तैयार करें। एक सरगर्मी डिवाइस पर दूसरे समाशोधन समाधान से भरे बीकर में छिद्रित ट्यूब रखो।फिर मस्तिष्क को बीकर में रखें और ब्लीचिंग को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ इसे सील करें। ऊतक पारदर्शी हो जाने के बाद, मस्तिष्क को 24 घंटे के लिए 70 आरपीएम पर रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट में पीबीएसटी में स्थानांतरित करें। समाधान को ताजा PBST के साथ बदलें और एक और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेशन जारी रखें।फिर मस्तिष्क को 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में स्थानांतरित करें। 24 घंटे के बाद, पीबीएस से मस्तिष्क को हटा दें और इसे अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में स्थानांतरित करें। रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क को इनक्यूबेट करें।सबसे पहले, नमूना स्लाइड के बीच में रखें। गर्म गोंद का उपयोग करके, स्लाइड के किनारों पर दीवारें बनाएं, लगभग ऊतक के रूप में उच्च। कोनों में से एक पर एक छोटा सा अंतर छोड़ना सुनिश्चित करें।जैसा कि गर्म गोंद परत मस्तिष्क स्लाइस की ऊंचाई तक पहुंचती है, ऊपरी सतह को नम करने और बुलबुला गठन को रोकने के लिए नमूने पर अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान की एक से दो बूंदों को लागू करें। जबकि गर्म गोंद अभी भी तरल है, एक कवर स्लिप के साथ शीर्ष को सील करें, इसे यथासंभव समान रूप से रखें, फिर कक्ष को अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान के साथ भरें। गर्म गोंद के साथ अंतराल को बंद करें।यदि गर्म गोंद की दीवारें स्लाइड की सीमाओं से परे फैली हुई हैं, तो विस्तारित किनारों को काटें। यदि इमेजिंग के लिए एक तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया जाता है, तो विसर्जन समाधान को बनाए रखने के लिए कवर स्लिप के ऊपर की दीवारों में गोंद के एक और दो से तीन मिलीमीटर जोड़ें। इस प्रोटोकॉल के बाद, मस्तिष्क के ऊतकों को साफ कर दिया जाएगा।माउस हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स की आबादी की कल्पना करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्पष्ट मस्तिष्क स्लाइस तैयार किए गए थे। सभी एस्ट्रोसाइट्स ने टीडीटोमेटो व्यक्त किया और उत्तेजक न्यूरॉन्स ने अपने नाभिक में एच 2 बी-जीएफपी व्यक्त किया। स्पष्ट ऊतक के लिए तैयार कक्ष दो फोटॉन या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग के लिए इष्टतम था।दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, माउस हिप्पोकैम्पस के सीए 1 क्षेत्र के एक साफ खंड में 300 से अधिक एस्ट्रोसाइट्स देखे गए थे। लाल और पिरामिड कोशिकाओं में हिप्पोकैम्पस एस्ट्रोसाइट्स, हरे रंग में सोमाटा दिखाई देते थे और मोटे, पारदर्शी ऊतक थे जो इन दो सेल प्रकारों के बीच स्थानिक निकटता का प्रतिनिधित्व करते थे। एक स्कैनिंग लेजर confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, उत्तेजक न्यूरॉन्स से अक्षीय बंडलों को एक पूरे गोलार्ध में खोजा गया था।हरे रंग के बंडलों को पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से सुपर मैमिलरी निकायों की ओर खोजा गया था। लाल बंडलों को वेंट हिप्पोकैम्पस में उनके मूल की ओर मामिलरी निकायों से पता लगाया गया था। तापमान, सांद्रता और इनक्यूबेशन समय जैसे कारकों ने स्पष्टता प्रक्रिया के परिणाम को प्रभावित किया।इसलिए, प्रोटोकॉल के हर चरण में सटीकता स्पष्ट ऊतक प्राप्त करने की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। इस तकनीक का उपयोग करके, हम कई मस्तिष्क संरचनाओं में न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के बीच की दूरी को मापते हैं। इस प्रोटोकॉल ने पिछले अध्ययनों की तुलना में अधिक कोशिकाओं के परिमाण के दो से तीन क्रमों के विश्लेषण की अनुमति दी।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

अलगाव और माउस Cortical Astrocytes की संस्कृति

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

स्पर्श कंडीशनिंग और हनी मधुमक्खियों में antennal नमूनाकरण रणनीति का आंदोलन विश्लेषण (<em&gt; एपीआई mellifera</emएल)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

एक घिराव परख: सीएनएस फ़ैगोसाइट और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

भ्रूण कृंतक दिमाग से प्राथमिक Mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, संस्कृति और लंबी अवधि के रखरखाव

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes की तीन आयामी Confocal morphometric विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

अलगाव और आरएनए लार्वा Zebrafish दिमाग से न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और Microglia का निष्कर्षण

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

विलायक-स्पष्ट मस्तिष्क ऊतक में रेबीज वायरस संक्रमण के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

एस्ट्रोसाइट्स में ऑर्गेनेल्स और अन्य कार्गो के इंट्रासेल्यूलर ट्रांसपोर्ट का दृश्य और विश्लेषण करना

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

क्षेत्रीय-विशिष्ट मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के साथ एएलएस मॉडलिंग के लिए एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म की स्थापना

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...