Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 803589), dalla Israel Science Foundation (sovvenzione ISF n. 1815/18) e dalle sovvenzioni Canada-Israele (CIHR-ISF, sovvenzione n. 2591/18). Ringraziamo Nechama Novick per aver commentato l'intero manoscritto.

I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università ebraica e hanno soddisfatto le linee guida della Guida dell'Istituto Nazionale di Salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Trasduzione del vettore virale
NOTA: La trasduzione del vettore virale viene utilizzata per esprimere fluorofori nel cervello.
<ol><li>Utilizzare un atlante (ad esempio, Allen Brain Atlas) per indiv...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

I metodi di compensazione dei tessuti rappresentano uno strumento rivoluzionario nella ricerca sul cervello, invitando a domande che in precedenza non avrebbero potuto essere poste. Dal targeting delle proprietà di un piccolo gruppo di cellule, una singola cellula o anche una singola sinapsi, CLARITY ora consente il targeting di popolazioni cellulari totali o funzionalità di connettività a lungo raggio utilizzando fluorofori pertinenti.
Il risultato dell'espressione del fluoroforo e della c...

Negli ultimi anni, la conoscenza della funzione degli astrociti e di come interagiscono con i circuiti neuronali è aumentata drasticamente. Gli astrociti possono influenzare la plasticità 1,2, aiutare nel recupero neuronale post-infortunio 3,4 e persino indurre un potenziamento neuronale de novo, con studi recenti che mostrano l'importanza degli astrociti nell'acquisizione e nella ricompensa della memoria, precedentemente considerate come funzioni puramente neuronali 5,6,7 . Una caratteristica di particolare interesse nella ricerca sugli astrociti è la disposizione spaziale delle cellule, che mantengono organizzazioni spaziali uniche nell'ippocampo e in altre strutture cerebrali 8,9,10. A differenza dei dendriti neuronali che si intrecciano tra i somata cellulari, gli astrociti ippocampali abitano territori visivamente distinguibili con una leggera sovrapposizione tra i loro processi, creando domini distinti 8,11,12,13. Le prove a sostegno della partecipazione degli astrociti nei circuiti neuronali non supportano la mancanza di una descrizione anatomica dettagliata di tali popolazioni e dei neuroni nei loro domini14.
Le procedure di trasduzione del vettore virale, insieme agli animali transgenici (TG), sono state rese popolari come set di strumenti per studiare le strutture cerebrali, le funzioni e le interazioni cellulari15,16. L'utilizzo di diversi promotori consente il targeting di cellule specifiche in base alle loro proprietà genetiche, ai livelli di attivazione17,18 o agli obiettivi di proiezione. Virus diversi possono esprimere fluorofori di colore diverso in diverse popolazioni. Un virus può essere combinato con l'espressione endogena di fluorofori in TG, oppure gli animali TG possono essere utilizzati senza la necessità di virus. Queste tecniche sono ampiamente utilizzate per la marcatura neuronale e alcuni laboratori hanno iniziato a utilizzarle con modifiche specializzate per il targeting di altri tipi di cellule, come gli astrociti 5,9,19.
La tecnica CLARITY, descritta per la prima volta nel 201320,21, consente lo studio di spesse fette di cervello rendendo trasparente l'intero cervello lasciando intatte le strutture microscopiche. Combinando i due metodi - trasduzione virale del vettore e pulizia dei tessuti - è ora disponibile l'opzione di esaminare le interazioni spaziali tra diverse popolazioni di tipi cellulari. La maggior parte degli studi di interazione astrociti-neuroni sono stati eseguiti su fette di cervello sottili, con conseguente immagine di astrociti incompleti a causa dei loro grandi domini, limitando così radicalmente il numero di cellule analizzate. L'uso della tecnica CLARITY consente la caratterizzazione simultanea della risoluzione di singole cellule di popolazioni cellulari in volumi su larga scala. L'imaging di popolazioni cellulari con tag fluorescenti in cervelli chiari non fornisce una risoluzione sinaptica, ma consente una caratterizzazione approfondita delle interazioni spaziali tra astrociti e una varietà di tipi di cellule neuronali.
Per questo motivo, abbiamo sfruttato queste tecniche all'avanguardia per studiare le proprietà degli astrociti in tutto il CA1 dorsale, immaginando tutte le lamina (Stratum Radiatum, strato piramidale e Stratum Oriens). Abbiamo misurato decine di migliaia di astrociti (con penetranza virale di >96%5), analizzando così le informazioni dell'intera popolazione astrocitica intorno a CA1. Con un'efficace penetranza dei marcatori neuronali, abbiamo potuto registrare le interazioni tra l'intera popolazione di astrociti CA1 e i quattro tipi di cellule neuronali: parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neuroni inibitori VIP e cellule piramidali eccitatorie9.
Diversi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una combinazione di fluorescenza da animali TG e vettori virali di colore diverso (tutte le cellule inibitorie), mentre altri (eccitatori) hanno utilizzato due vettori virali che esprimono diversi fluorofori sotto diversi promotori9. Questo documento presenta un protocollo dettagliato, che include l'etichettatura delle cellule desiderate nel cervello, rendendo il cervello trasparente utilizzando una procedura CLARITY modificata, nonché l'imaging e l'analisi di strutture cerebrali complete, utilizzando varie procedure e software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione dei tessuti utilizzando il metodo CLARITY consente di studiare contemporaneamente diversi tipi di cellule cerebrali e le loro interazioni. La trasduzione del vettore virale consente la marcatura di diversi tipi di cellule in diversi colori di fluorescenza all'interno dello stesso tessuto. Le cellule possono essere identificate geneticamente per attività o proiezione. Utilizzando un protocollo CLARITY modificato, la dimensione potenziale del campione di astrociti e neuroni è cresciuta di 2-3 ordini di grandezza. L'uso di CLARITY consente l'imaging di astrociti completi, che sono troppo grandi per adattarsi nella loro interezza a fette, e l'esame dei somata con tutti i loro processi. Inoltre, offre l'opportunità di studiare l'interazione spaziale tra astrociti e diversi tipi di cellule neuronali, vale a dire, il numero di neuroni piramidali in ciascun dominio astrocitico o la vicinanza tra astrociti e specifiche popolazioni di neuroni inibitori. Questo documento descrive, in dettaglio, come questi metodi devono essere applicati.

La corretta eliminazione di spesse fette di tessuto cerebrale si traduce in una nuova gamma di domande che possono essere poste riguardo alle proprietà di grandi popolazioni cellulari rispetto alle proprietà di singole cellule o gruppi vicini di cellule. Per ottenere risultati di successo, si dovrebbe rispettare rigorosamente il protocollo CLARITY, in quanto esiste una vasta gamma di parametri che devono essere considerati per ridurre la varianza tra i campioni (ad esempio, percentuale di chiarezza, informazioni sulla ...

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Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.

Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

La tecnica di chiarezza descritta per la prima volta nel 2013 è una tecnica di compensazione dei tessuti che consente il campionamento di grandi quantità di cellule, vasi sanguigni, quindi anche proteine come una singola risoluzione cellulare in spesse fette di cervello. Questa tecnica consente lo studio di strutture microscopiche intatte rendendo trasparente l'intero cervello. Questo protocollo è un chip semplice e una pipeline diretta per la pulizia dei tessuti.Questa tecnica può essere utilizzata per eliminare i tessuti in altri sistemi oltre ai tessuti cerebrali. Per iniziare, sigillare il tubo e il cappuccio usando il parafilm e forare due fori nel cappuccio. Quindi trasferire il gas azoto dal serbatoio utilizzando un tubo flessibile con un diametro interno di cinque millimetri e un ago calibro 19 collegato alla sua estremità.Iniziare il degasaggio attaccando il tubo al tubo e consentendo lo scambio di gas per 30 minuti a temperatura ambiente. Staccare il tubo e sigillare immediatamente i fori con argilla modellante. Quindi trasferire i tubi sigillati degas in un bagno di 37 gradi Celsius per 3 1/2 ore per polimerizzare la soluzione di idrogel.Togli il cervello dal tubo. Utilizzando salviette da laboratorio, rimuovere l'idrogel polimerizzato intorno al cervello assicurando che nessun gel residuo rimanga attaccato alla superficie del cervello. Dividi il cervello in fette spesse che contengono tutte le aree di interesse.Mettere le fette nella prima soluzione di compensazione e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Nel frattempo, prepara un tubo perforato per posizionare il cervello. Mettere il tubo perforato in un becher riempito con una seconda soluzione di compensazione su un dispositivo di agitazione.Quindi posizionare il cervello nel becher e sigillarlo con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento. Dopo che il tessuto diventa trasparente, trasferire il cervello in PBST in incubazione a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Sostituire la soluzione con PBST fresco e continuare l'incubazione per altre 24 ore.Quindi trasferire il cervello a PBS a temperatura ambiente per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il cervello dalla PBS e trasferirlo in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Incubare il cervello a 37 gradi Celsius durante la notte.Innanzitutto, posizionare il campione al centro della diapositiva. Usando la colla a caldo, crea pareti sui bordi della diapositiva, quasi alte come il tessuto. Assicurati di lasciare un piccolo spazio in uno degli angoli.Quando lo strato di colla a caldo si avvicina all'altezza della fetta di cervello, applicare una o due gocce della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione sul campione per inumidire la superficie superiore e prevenire la formazione di bolle. Mentre la colla a caldo è ancora liquida, sigillare la parte superiore con un coperchio, posizionandolo nel modo più uniforme possibile, quindi riempire la camera con la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Chiudere lo spazio con la colla a caldo.Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi estensibili. Se per l'imaging viene utilizzato un obiettivo di immersione in olio, aggiungere altri due o tre millimetri di colla alle pareti sopra lo slittamento del coperchio per mantenere la soluzione di immersione. Dopo questo protocollo, il tessuto cerebrale verrà eliminato.Sono state preparate chiare fette di cervello utilizzando questo protocollo per visualizzare popolazioni di astrociti e neuroni nella regione CA1 dell'ippocampo del topo. Tutti gli astrociti hanno espresso tdTomato e neuroni eccitatori che hanno espresso H2B-GFP nei loro nuclei. La camera preparata per il tessuto chiarificato era ottimale per l'imaging al microscopio a due fotoni o confocali.Utilizzando un microscopio a due fotoni, sono stati osservati oltre 300 astrociti in una sezione eliminata della regione CA1 dell'ippocampo del topo. Gli astrociti ippocampali nelle cellule rosse e piramidali, i somata in verde erano visibili e il tessuto spesso e trasparente che rappresentava la vicinanza spaziale tra questi due tipi di cellule. Utilizzando un microscopio confocale laser a scansione, i fasci assonali dei neuroni eccitatori sono stati tracciati su un intero emisfero.I fasci verdi sono stati tracciati dall'ippocampo dorsale verso i corpi super mamillari. I fasci rossi sono stati tracciati dai corpi mamillari verso la loro origine nell'ippocampo di sfiato. Fattori come la temperatura, le concentrazioni e il tempo di incubazione hanno influenzato l'esito della procedura di chiarezza.Pertanto, la precisione in ogni fase del protocollo è vitale per il successo del raggiungimento di tessuti chiari. Usando questa tecnica, misuriamo le distanze tra neuroni e astrociti in diverse strutture cerebrali. Questo protocollo ha permesso l'analisi di due o tre ordini di grandezza in più di cellule rispetto agli studi precedenti.

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