Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

이 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 No 803589), 이스라엘 과학 재단 (ISF 보조금 번호 1815/18) 및 캐나다 - 이스라엘 보조금 (CIHR-ISF, 보조금 번호 2591/18)에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. 전체 원고에 대해 의견을 주신 Nechama Novick에게 감사드립니다.

실험 프로토콜은 히브리 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건 연구소 가이드의 지침을 충족했습니다.
1. 바이러스 벡터 형질도입
참고: 바이러스 벡터 형질도입은 뇌에서 형광단을 발현하는 데 사용됩니다.
<ol><li>아틀라스 (예 : Allen Brain Atlas)를 사용하여 대상 영역의 관련 조정을 찾...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

조직 제거 방법은 뇌 연구에서 혁신적인 도구를 제시하여 이전에는 질문 할 수 없었던 질문을 초대합니다. 작은 세포 그룹, 단일 세포 또는 심지어 단일 시냅스의 특성을 표적화하는 것으로부터, CLARITY는 이제 관련 형광단을 사용하여 전체 세포 집단 또는 장거리 연결 특징의 표적화를 가능하게 한다.
형광단 발현 및 CLARITY 절차 조합의 결과는 바이너리가 아니며; 많은 요인들?...

최근 몇 년 동안, 성상 세포 기능에 대한 지식과 그들이 신경 회로와 상호 작용하는 방법이 극적으로 증가했습니다. 성상세포는 가소성1,2에 영향을 미치고, 신경 손상 후 회복을 돕고, 3,4를 돕고, 심지어 드노보 뉴런 강화를 유도할 수 있으며, 최근 연구들은 기억 획득 및 보상에서 성상세포의 중요성을 보여주었으며, 이전에는 순전히 신경 기능으로 간주되었다 5,6,7 . 성상세포 연구에 특히 관심을 갖는 특징은 해마 및 기타 뇌 구조8,9,10에서 독특한 공간 조직을 유지하는 세포의 공간 배열입니다. 세포 소마타 사이에 얽혀있는 뉴런 수상 돌기와는 달리, 해마 성상 세포는 시각적으로 구별 가능한 영역에 서식하며 과정 사이에 약간의 겹침이 생겨 별개의 도메인 8,11,12,13을 만듭니다. 뉴런 회로에서 성상세포의 참여를 뒷받침하는 증거는 그러한 집단 및 뉴런의 도메인14에 대한 상세한 해부학적 설명의 부족을 지지하지 않는다.
바이러스 벡터 형질도입 절차는 형질전환 동물(TG)과 함께 뇌 구조, 기능 및 세포 상호작용을 조사하기 위한 도구 세트로서 대중화되었다(15,16). 상이한 프로모터의 이용은 그들의 유전적 특성, 활성화 수준17,18, 또는 프로젝션 표적에 따라 특정 세포의 표적화를 허용한다. 다른 바이러스는 다른 집단에서 다른 색깔의 형광단을 발현할 수 있다. 바이러스는 TG에서 형광단의 내인성 발현과 조합될 수 있거나, 또는 TG 동물은 바이러스를 필요로 하지 않고 사용될 수 있다. 이러한 기술은 뉴런 마킹에 널리 사용되며, 일부 실험실에서는 성상 세포 5,9,19와 같은 다른 세포 유형을 타겟팅하는 데 특화된 변형과 함께 사용하기 시작했습니다.
2013 20,21에서 처음 설명 된 CLARITY 기술은 미세한 구조를 그대로 유지하면서 전체 뇌를 투명하게 만들어 두꺼운 뇌 조각을 연구 할 수있게합니다. 바이러스 벡터 형질도입과 조직 제거라는 두 가지 방법을 조합함으로써 서로 다른 세포 유형 집단 간의 공간적 상호작용을 조사하는 옵션이 이제 이용가능하다. 대부분의 성상세포-뉴런 상호작용 연구는 얇은 뇌 조각에 대해 수행되었으며, 그 결과 큰 도메인으로 인해 불완전한 성상세포의 이미지가 생성되어 분석된 세포의 수가 근본적으로 제한되었다. CLARITY 기술을 사용하면 대규모 부피의 세포 집단의 단일 세포 분해능 특성화를 동시에 수행할 수 있습니다. 맑은 뇌에서 형광으로 태그가 붙은 세포 집단을 이미징하는 것은 시냅스 분해능을 전달하지 않지만 성상세포와 다양한 신경 세포 유형 사이의 공간적 상호 작용을 철저히 특성화할 수 있습니다.
이러한 이유로 우리는 이러한 최첨단 기술을 활용하여 등쪽 CA1 전체에 걸친 성상 세포의 특성을 조사하고 모든 라미나 (Stratum Radiatum, pyramidal layer 및 Stratum Oriens)를 이미징했습니다. 우리는 수만 개의 성상 세포 (바이러스 침투율 >96 % 5)를 측정하여 CA1 주변의 전체 성상 세포 집단의 정보를 분석했습니다. 뉴런 마커의 효율적인 침투를 통해, 우리는 CA1 성상세포의 전체 집단과 네 가지 유형의 뉴런 세포 - 파브알부민 (PV), 소마토스타틴 (SST), VIP 억제 뉴런 및 흥분성 피라미드 세포9 사이의 상호 작용을 기록 할 수있었습니다.
몇몇 실험은 TG 동물로부터의 형광과 상이한 착색된 바이러스 벡터 (모든 억제 세포)의 조합을 사용하여 수행되었고, 다른 것들 (흥분성)은 상이한 프로모터9 하에서 상이한 형광단을 발현하는 두 개의 바이러스 벡터를 이용하였다. 이 논문은 뇌에서 원하는 세포의 태깅, 수정 된 CLARITY 절차를 사용하여 뇌를 투명하게 만드는 것, 다양한 절차와 소프트웨어를 사용하여 완전한 뇌 구조를 이미징 및 분석하는 등 상세한 프로토콜을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 조직 제거를 결합하면 여러 유형의 뇌 세포와 그 상호 작용을 동시에 조사 할 수 있습니다. 바이러스 벡터 형질도입은 동일한 조직 내에서 상이한 형광 색상으로 다양한 세포 유형의 마킹을 가능하게 한다. 세포는 활성 또는 돌출에 의해 유전적으로 확인될 수 있다. 변형된 CLARITY 프로토콜을 사용하여, 성상세포 및 뉴런의 잠재적 표본 크기는 2-3배 정도 성장하였다. CLARITY의 사용은 조각에 전체적으로 들어가기에는 너무 큰 완전한 성상 세포의 이미징과 모든 과정으로 소마타를 검사 할 수있게합니다. 또한, 성상세포와 상이한 뉴런 세포 유형 사이의 공간적 상호작용, 즉 각 성상세포 도메인에서 피라미드형 뉴런의 수 또는 성상세포와 특정 억제 뉴런 집단 사이의 근접성을 조사할 수 있는 기회를 제공한다. 이 백서에서는 이러한 방법을 어떻게 적용해야 하는지 자세히 설명합니다.

두꺼운 뇌 조직 조각을 성공적으로 제거하면 단일 세포 또는 이웃 세포 그룹의 특성과는 달리 큰 세포 집단의 특성에 관해 질문 할 수있는 새로운 범위의 질문이 생깁니다. 성공적인 결과를 얻기 위해서는 샘플 간의 분산을 줄이기 위해 고려해야 할 광범위한 매개 변수 (예 : 선명도, 형광 정보, 팽윤도 매개 변수)가 있으므로 CLARITY 프로토콜을 엄격하게 준수해야합니다.
<strong ...

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Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 뇌 제거를 결합하면 많은 수의 뉴런과 성상세포를 동시에 조사할 수 있습니다.

맑은 뇌에서 성상세포와 뉴런 사이의 공간적 상호작용 조사

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

2013 년에 처음 설명 된 선명도 기술은 다량의 세포, 혈관, 심지어 단백질조차도 두꺼운 뇌 조각에서 단일 세포 분해능을 샘플링 할 수있게 해주는 조직 제거 기술입니다. 이 기술은 전체 뇌를 투명하게 만들어 손상되지 않은 현미경 구조를 연구 할 수있게합니다. 이 프로토콜은 간단한 칩과 조직 정리를위한 간단한 파이프 라인입니다.이 기술은 뇌 조직 외에도 다른 시스템의 조직을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 파라 필름을 사용하여 튜브와 캡을 밀봉하고 캡에 두 개의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 내부 직경이 다섯 밀리미터 인 유연한 파이프와 끝에 연결된 19 게이지 바늘을 사용하여 탱크에서 질소 가스를 이송하십시오.파이프를 튜브에 부착하고 실온에서 30 분 동안 가스 교환을 허용하여 탈기를 시작하십시오. 파이프를 분리하고 즉시 모델링 점토로 구멍을 밀봉하십시오. 그 후 탈가스 밀봉된 튜브를 섭씨 37도 욕조로 3 1/2시간 동안 이송하여 하이드로겔 용액을 중합시킨다.튜브에서 뇌를 꺼내십시오. 실험실 물티슈를 사용하여 뇌 주위의 중합 된 하이드로 젤을 제거하여 잔류 겔이 뇌 표면에 부착되지 않도록하십시오. 뇌를 모든 관심 영역을 포함하는 두꺼운 조각으로 나눕니다.슬라이스를 첫 번째 클리어링 용액에 넣고 섭씨 37도에서 24시간 동안 70RPM에서 회전하면서 인큐베이션한다. 그 동안 뇌를 배치하기 위해 천공 된 튜브를 준비하십시오. 천공된 튜브를 교반 장치 상의 초클리어링 용액으로 채워진 비이커에 넣는다.그런 다음 뇌를 비이커에 넣고 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 밀봉하십시오. 조직이 투명하게 변한 후, 뇌를 PBST로 옮기고 섭씨 37도에서 24시간 동안 70RPM에서 회전하면서 배양한다. 용액을 신선한 PBST로 교체하고 또 다른 24시간 동안 인큐베이션을 계속한다.그런 다음 뇌를 실온에서 24시간 동안 PBS로 옮긴다. 24시간 후, PBS로부터 뇌를 제거하고 굴절률 매칭 용액으로 옮긴다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 뇌를 배양하십시오.먼저 샘플을 슬라이드 중간에 놓습니다. 뜨거운 접착제를 사용하여 슬라이드 가장자리에 거의 조직만큼 높은 벽을 만듭니다. 모서리 중 하나에 작은 틈새를 남겨 두십시오.뜨거운 접착제 층이 뇌 조각의 높이에 접근하면 샘플에 굴절률 일치 용액의 한 방울에서 두 방울을 떨어 뜨려 윗면을 적시고 거품 형성을 방지하십시오. 뜨거운 접착제는 여전히 액체이지만 커버 슬립으로 상단을 밀봉하고 가능한 한 고르게 놓은 다음 굴절률 일치 용액으로 챔버를 채 웁니다. 뜨거운 접착제로 틈을 닫으십시오.뜨거운 접착제 벽이 슬라이드의 테두리 너머로 확장되면 연장 모서리를 자릅니다. 오일 침지 목표를 이미징에 사용하는 경우 커버 슬립 위의 벽에 두 세 밀리미터의 접착제를 더 추가하여 침지 용액을 유지합니다. 이 프로토콜 후에, 뇌 조직은 제거될 것이다.명확한 뇌 조각은 마우스 해마의 CA1 영역에서 성상세포 및 뉴런의 집단을 시각화하기 위해 이 프로토콜을 사용하여 제조되었다. 모든 성상세포는 tdTomato를 발현하고 흥분성 뉴런은 그들의 핵에서 H2B-GFP를 발현하였다. 정화된 조직을 위해 준비된 챔버는 두 개의 광자 또는 공초점 현미경 하에서 이미징에 최적이었다.두 개의 광자 현미경을 사용하여, 마우스 해마의 CA1 영역의 클리어 섹션에서 300개 이상의 성상세포가 관찰되었다. 적색 및 피라미드 세포에서의 해마 성상세포, 녹색의 소마타는 이들 두 세포 유형 사이의 공간적 근접성을 나타내는 가시적이고 두껍고 투명한 조직이었다. 스캐닝 레이저 공초점 현미경을 사용하여, 흥분성 뉴런으로부터의 축삭 다발을 전체 반구에 걸쳐 추적하였다.녹색 번들은 등쪽 해마에서 슈퍼 모성체쪽으로 추적되었습니다. 빨간 뭉치는 모성체에서 통풍구 해마에서 기원을 향해 추적되었습니다. 온도, 농도 및 배양 시간과 같은 요인은 명확성 절차의 결과에 영향을 미쳤습니다.따라서 프로토콜의 모든 단계에서 정밀도는 명확한 조직을 성공적으로 달성하는 데 필수적입니다. 이 기술을 사용하여 우리는 여러 뇌 구조에서 뉴런과 성상 세포 사이의 거리를 측정합니다. 이 프로토콜은 이전 연구에서보다 두 세 배 더 많은 크기의 세포를 분석 할 수있었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

촉각 시설과 꿀벌에 Antennal 샘플링 전략의 움직임 분석 (<em&gt; API를 mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...