Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Dette prosjektet har fått støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale Nr. 803589), Israel Science Foundation (ISF grant No. 1815/18) og Canada-Israel grants (CIHR-ISF, grant No. 2591/18). Vi takker Nechama Novick for å ha kommentert hele manuskriptet.

Eksperimentelle protokoller ble godkjent av Det hebraiske universitetets dyrepleie- og brukskomité og oppfylte retningslinjene fra National Institute of Health Guide for care and use of Laboratory Animals.
1. Viral vektortransduksjon
MERK: Viral vektortransduksjon brukes til å uttrykke fluoroforer i hjernen.
<ol><li>Bruk et atlas (f.eks. Allen Brain Atlas) for å finne relevant koordinering av målområdet. MERK: 3D-atlas finner du på nettet...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Vevsryddingsmetoder presenterer et revolusjonerende verktøy i hjerneforskning, og inviterer spørsmål som ikke tidligere kunne ha blitt stilt. Fra å målrette egenskapene til en liten gruppe celler, en enkelt celle eller til og med en enkelt synapse, gjør CLARITY nå det mulig å målrette mot totale cellepopulasjoner eller langtrekkende tilkoblingsfunksjoner ved hjelp av relevante fluoroforer.
Utfallet av fluoroforuttrykket og CLARITY-prosedyrekombinasjonen er ikke binært; mange faktorer...

De siste årene har kunnskapen om astrocyttfunksjon og hvordan de samhandler med nevronkretser økt dramatisk. Astrocytter kan påvirke plastisitet 1,2, bistå i nevronal postinjury utvinning 3,4, og til og med indusere de novo nevronal potensiering, med nyere studier som viser betydningen av astrocytter i minneoppkjøp og belønning, tidligere ansett som rent nevronale funksjoner 5,6,7 . Et trekk ved spesiell interesse for astrocyttforskning er det romlige arrangementet av cellene, som opprettholder unike romlige organisasjoner i hippocampus og andre hjernestrukturer 8,9,10. I motsetning til de nevronale dendrittene som blander seg mellom celle somata, beboer hippocampale astrocytter visuelt skille territorier med liten overlapping mellom prosessene sine, og skaper forskjellige domener 8,11,12,13. Bevisene som støtter deltakelse av astrocytter i nevronkretser støtter ikke mangelen på detaljert anatomisk beskrivelse av slike populasjoner og nevronene i deres domener14.
Virale vektortransduksjonsprosedyrer, sammen med transgene dyr (TG), har blitt popularisert som et verktøysett for å undersøke hjernestrukturer, funksjoner og celleinteraksjoner15,16. Bruken av forskjellige promotorer tillater målretting av spesifikke celler i henhold til deres genetiske egenskaper, aktiveringsnivåer17,18 eller projeksjonsmål. Ulike virus kan uttrykke forskjellige fargede fluoroforer i forskjellige populasjoner. Et virus kan kombineres med det endogene uttrykket av fluoroforer i TG, eller TG-dyr kan brukes uten behov for virus. Disse teknikkene er mye brukt til nevronmarkering, og noen laboratorier har begynt å bruke dem med modifikasjoner spesialisert for å målrette mot andre celletyper, for eksempel astrocytter 5,9,19.
CLARITY-teknikken, først beskrevet i 201320,21, muliggjør studiet av tykke hjerneskiver ved å gjøre hele hjernen gjennomsiktig mens du lar de mikroskopiske strukturene være intakte. Ved å kombinere de to metodene-viral vektortransduksjon og vev clearing-muligheten til å undersøke romlige interaksjoner mellom ulike celle type populasjoner er nå tilgjengelig. De fleste astrocytt-neuron interaksjonsstudier ble utført på tynne hjerneskiver, noe som resulterte i bilder av ufullstendige astrocytter på grunn av deres store domener, og dermed radikalt begrense antall analyserte celler. Bruken av CLARITY-teknikken tillater encellet oppløsningskarakterisering av cellepopulasjoner i store volumer samtidig. Avbildning av fluorescerende merkede cellepopulasjoner i klare hjerner gir ikke synaptisk oppløsning, men tillater grundig karakterisering av de romlige interaksjonene mellom astrocytter og en rekke nevronale celletyper.
Av den grunn utnyttet vi disse toppmoderne teknikkene for å undersøke egenskapene til astrocytter i hele dorsal CA1, og identifiserte alle lamina (Stratum Radiatum, pyramidelag og Stratum Oriens). Vi målte titusenvis av astrocytter (med viral penetrans på >96%5), og analyserte dermed informasjonen til hele den astrocytiske befolkningen rundt CA1. Med effektiv penetrans av nevronmarkørene kunne vi registrere interaksjonene mellom hele befolkningen i CA1 astrocytter og de fire typer nevronale celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hemmende nevroner og eksitatoriske pyramidale celler9.
Flere eksperimenter ble utført ved hjelp av en kombinasjon av fluorescens fra TG-dyr og forskjellige fargede virale vektorer (alle hemmende celler), mens andre (eksitatoriske) brukte to virale vektorer som uttrykte forskjellige fluoroforer under forskjellige promotorer9. Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll, inkludert merking av de ønskede cellene i hjernen, noe som gjør hjernen gjennomsiktig ved hjelp av en modifisert CLARITY-prosedyre, samt avbildning og analyse av komplette hjernestrukturer, ved hjelp av ulike prosedyrer og programvare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

Ved å kombinere viral vektortransduksjon og vevsrydding ved hjelp av CLARITY-metoden, kan du samtidig undersøke flere typer hjerneceller og deres interaksjoner. Viral vektortransduksjon muliggjør merking av forskjellige celletyper i forskjellige fluorescensfarger i samme vev. Celler kan identifiseres genetisk ved aktivitet eller projeksjon. Ved hjelp av en modifisert CLARITY-protokoll har den potensielle prøvestørrelsen på astrocytter og nevroner vokst med 2-3 størrelsesordener. Bruken av CLARITY tillater avbildning av komplette astrocytter, som er for store til å passe i sin helhet i skiver, og undersøkelse av somata med alle sine prosesser. I tillegg gir det muligheten til å undersøke den romlige interaksjonen mellom astrocytter og forskjellige nevroncelletyper, nemlig antall pyramidale nevroner i hvert astrocytisk domene eller nærheten mellom astrocytter og spesifikke hemmende nevronpopulasjoner. Dette dokumentet beskriver i detalj hvordan disse metodene skal brukes.

Vellykket rydding av tykke hjernevevsskiver resulterer i et nytt utvalg av spørsmål som kan stilles om egenskapene til store cellepopulasjoner i motsetning til egenskapene til enkeltceller eller nærliggende grupper av celler. For å oppnå vellykkede resultater, bør man strengt følge CLARITY-protokollen, da det er et bredt spekter av parametere som må vurderes for å redusere variansen mellom prøver (f.eks. prosentandel av klarhet, fluorescensinformasjon, hovne parametere).
<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Ved å kombinere viral vektortransduksjon og hjernerydding ved hjelp av CLARITY-metoden kan du undersøke et stort antall nevroner og astrocytter samtidig.

Undersøkelse av romlig interaksjon mellom astrocytter og nevroner i klarerte hjerner

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Klarhetsteknikken som først ble beskrevet i 2013 er en vevsryddingsteknikk som muliggjør prøvetaking av større mengder celler, blodkar, så selv proteiner en slik enkelt celleoppløsning i tykke hjerneskiver. Denne teknikken gjør det mulig å studere intakte mikroskopiske strukturer ved å gjøre hele hjernen gjennomsiktig. Denne protokollen er en enkel chip og grei rørledning for vev klart.Denne teknikken kan brukes til å rydde vev i andre systemer i tillegg til hjernevev. For å begynne, forsegle røret og hetten ved hjelp av parafilm og punktering to hull i hetten. Overfør deretter nitrogengass fra tanken ved hjelp av et fleksibelt rør med fem millimeter innvendig diameter og en 19 gauge nål tilkoblet på slutten.Start avgassingen ved å feste røret til røret og la gassen byttes i 30 minutter ved romtemperatur. Løsne røret og forsegle umiddelbart hullene med modelleringsleire. Overfør deretter degas forseglede rør til et 37 grader celsius bad i 3 1/2 timer for å polymerisere hydrogeloppløsningen.Ta hjernen ut av røret. Bruk laboratorieservietter, fjern den polymeriserte hydrogelen rundt hjernen og sørg for at ingen gjenværende gel forblir festet til overflaten av hjernen. Del hjernen i tykke skiver som inneholder alle interesseområder.Sett skivene i den første ryddeløsningen og inkuber ved 37 grader Celsius med rotasjon ved 70 RPM i 24 timer. I mellomtiden forbereder du et perforert rør for å plassere hjernen. Sett det perforerte røret i et beger fylt med andre avregningsløsning på en røreenhet.Plasser deretter hjernen i begeret og forsegle det med aluminiumsfolie for å forhindre bleking. Etter at vevet blir gjennomsiktig, overfør hjernen til PBST i inkuber ved 37 grader Celsius med rotasjon ved 70 RPM i 24 timer. Bytt ut løsningen med frisk PBST og fortsett inkubasjonen i ytterligere 24 timer.Overfør deretter hjernen til PBS ved romtemperatur i 24 timer. Etter 24 timer, fjern hjernen fra PBS og overfør den til refraktiv indeksmatchingsløsning. Inkuber hjernen ved 37 grader Celsius over natten.Først plasserer du prøven midt i lysbildet. Ved hjelp av varmt lim, lag vegger på kantene av lysbildet, nesten like høyt som vevet. Sørg for å legge igjen et lite gap i et av hjørnene.Når det varme limlaget nærmer seg høyden på hjernestykket, bruk en til to dråper brytningsindeksmatchingsløsning på prøven for å fukte den øvre overflaten og forhindre bobledannelse. Mens det varme limet fortsatt er flytende, forsegler du toppen med en dekselglidning, plasserer den så jevnt som mulig og fyller deretter kammeret med brytningsindeksens matchende løsning. Lukk gapet med varmt lim.Hvis de varme limveggene strekker seg utover lysbildets kantlinjer, klipper du uttrekkskantene. Hvis et nedsenkingsmål for olje brukes til avbildning, tilsett ytterligere to til tre millimeter lim til veggene over dekselslippet for å beholde nedsenkningsløsningen. Etter denne protokollen vil hjernevevet bli ryddet.Klare hjerneskiver ble utarbeidet ved hjelp av denne protokollen for å visualisere populasjoner av astrocytter og nevroner i CA1-regionen av mus hippocampus. Alle astrocytter uttrykte tdTomato og eksitatoriske nevroner uttrykte H2B-GFP i sine kjerner. Kammeret som var forberedt på det avklarte vevet var optimalt for avbildning under et tofoton eller konfokalt mikroskop.Ved hjelp av et to fotonmikroskop ble over 300 astrocytter observert i en ryddet del av CA1-regionen av musen hippocampus. Hippocampal astrocytter i røde og pyramideceller, somata i grønt var synlige og tykke, gjennomsiktige vev som representerer den romlige nærheten mellom disse to celletypene. Ved hjelp av et konfokalt mikroskop for skanning ble axonalbunter fra eksitatoriske nevroner sporet over en hel halvkule.Grønne bunter ble sporet fra dorsal hippocampus mot supermamillære kropper. De røde buntene ble sporet fra mamillary kroppene mot deres opprinnelse ved vent hippocampus. Faktorer, som temperatur, konsentrasjoner og inkubasjonstid påvirket utfallet av klarhetsprosedyren.Derfor er presisitet i hvert trinn i protokollen avgjørende for å oppnå klart vev. Ved hjelp av denne teknikken måler vi avstandene mellom nevroner og astrocytter i flere hjernestrukturer. Denne protokollen tillot analyse av to til tre størrelsesorden flere celler enn i tidligere studier.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

Tactile Conditioning and Movement Analysis Of antennal Prøvetaking Strategies i Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

En engulfment analysen: En protokoll for å vurdere samspillet mellom CNS Fagocytter og Neuroner

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolasjon og RNA utvinning av Neurons, makrofager og Microglia fra larver sebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Høy-resolution 3D tenkelig av rabiat virus infeksjon inne løsemiddel-klarnet hjerne tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisere og analysere intracellulære transport av organeller og andre cargos i astrocytter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Etablering av en elektrofysiologisk plattform for modellering av ALS med regionalt spesifikke humane pluripotente stamcelleavledede astrocytter og nevroner

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...