Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (acordo de subvenção nº 803589), da Fundação Israelenta (isf grant nº 1815/18) e das bolsas Canadá-Israel (CIHR-ISF, conceder nº 2591/18). Agradecemos a Nechama Novick por comentar todo o manuscrito.

Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Hebraica e atenderam às diretrizes do Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Transdução de vetor viral
NOTA: A transdução vetorial viral é usada para expressar fluoroforos no cérebro.
<ol><li>Use um atlas (por exemplo, Allen Brain Atlas) para localizar a coordenação relevante da área alvo. NOTA: Atl...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Os métodos de limpeza de tecidos apresentam uma ferramenta revolucionária na pesquisa cerebral, convidando perguntas que não poderiam ter sido feitas anteriormente. A partir do direcionamento das propriedades de um pequeno grupo de células, uma única célula, ou mesmo uma única sinapse, a CLARITY agora permite o direcionamento de populações celulares totais ou recursos de conectividade de longo alcance usando fluoroforos relevantes.
O resultado da combinação de procedimentos fluorfor...

Nos últimos anos, o conhecimento da função astrócito e como eles interagem com circuitos neuronais aumentaram drasticamente. Os astrócitos podem influenciar a plasticidade 1,2, auxiliar na recuperação neuronal da lesãopós-lesão 3,4, e até induzir a potencialização neuronal de novo, com estudos recentes mostrando a importância dos astrócitos na aquisição e recompensa da memória, antes consideradas como funções puramente neuronais 5,6,7 . Uma característica de particular interesse na pesquisa de astrócito é o arranjo espacial das células, que mantêm organizações espaciais únicas no hipocampo e outras estruturas cerebrais 8,9,10. Ao contrário dos dendritos neuronais que se entrelaçam entre somata celular, os astrócitos hipocampais habitam territórios visualmente distinguíveis com ligeira sobreposição entre seus processos, criando domínios distintos 8,11,12,13. As evidências que sustentam a participação de astrócitos em circuitos neuronais não suportam a falta de descrição anatômica detalhada dessas populações e dos neurônios em seus domínios14.
Os procedimentos de transdução de vetores virais, juntamente com animais transgênicos (TG), têm sido popularizados como um acessório para investigar estruturas cerebrais, funções e interações celulares15,16. A utilização de diferentes promotores permite o direcionamento de células específicas de acordo com suas propriedades genéticas, níveis de ativação17,18 ou alvos de projeção. Diferentes vírus podem expressar diferentes fluoroforos coloridos em diferentes populações. Um vírus pode ser combinado com a expressão endógena de fluoroforos em TG, ou animais TG podem ser usados sem a necessidade de vírus. Essas técnicas são amplamente utilizadas para marcação neuronal, e alguns laboratórios começaram a usá-las com modificações especializadas para atingir outros tipos de células, como os astrócitos 5,9,19.
A técnica CLARITY, descrita pela primeira vez em2013 20,21, permite o estudo de fatias cerebrais grossas, tornando todo o cérebro transparente, deixando intactas as estruturas microscópicas. Combinando os dois métodos de transdução vetorial viral e limpeza tecidual- a opção de examinar as interações espaciais entre diferentes populações do tipo celular está agora disponível. A maioria dos estudos de interação astrócito-neurônio foram realizados em finas fatias cerebrais, resultando em imagens de astrócitos incompletos devido a seus grandes domínios, restringindo radicalmente o número de células analisadas. O uso da técnica CLARITY permite a caracterização de resolução unicelular de populações celulares em volumes em larga escala simultaneamente. Imagens fluorescentes marcadas populações de células em cérebros claros não fornecem resolução sináptica, mas permite uma caracterização completa das interações espaciais entre astrócitos e uma variedade de tipos de células neuronais.
Por essa razão, aproveitamos essas técnicas de última geração para investigar as propriedades dos astrócitos em todo o CA1 dorsal, imagens de toda lamina (Estrato Radiatum, camada piramimal e Stratum Oriens). Medimos dezenas de milhares de astrócitos (com penetração viral de >96%5), analisando assim as informações de toda a população astróctica em torno do CA1. Com penetração eficiente dos marcadores neuronais, pudemos registrar as interações entre toda a população de astrócitos ca1 e os quatro tipos de células neuronais-parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neurônios inibitórios VIP e células piramipelais excitatórias9.
Vários experimentos foram realizados usando uma combinação de fluorescência de animais TG e vetores virais de cores diferentes (todas as células inibitórias), enquanto outros (excitatório) utilizaram dois vetores virais expressando fluoroforos diferentes sob diferentes promotores9. Este artigo apresenta um protocolo detalhado, incluindo a marcação das células desejadas no cérebro, tornando o cérebro transparente usando um procedimento de CLARIDADE modificado, bem como imagens e análises de estruturas cerebrais completas, utilizando vários procedimentos e softwares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza tecidual usando o método CLARITY torna possível investigar simultaneamente vários tipos de células cerebrais e suas interações. A transdução vetorial viral permite a marcação de diversos tipos de células em diferentes cores de fluorescência dentro do mesmo tecido. As células podem ser identificadas geneticamente por atividade ou projeção. Usando um protocolo CLARITY modificado, o tamanho potencial da amostra de astrócitos e neurônios cresceu em 2-3 ordens de magnitude. O uso do CLARITY permite a imagem de astrócitos completos, que são muito grandes para caber em sua totalidade em fatias, e o exame do somata com todos os seus processos. Além disso, oferece a oportunidade de investigar a interação espacial entre astrócitos e diferentes tipos de células neuronais, ou seja, o número de neurônios piramihários em cada domínio astrócito ou a proximidade entre astrócitos e populações específicas de neurônios inibitórios. Este artigo descreve, em detalhes, como esses métodos devem ser aplicados.

A limpeza bem sucedida de fatias de tecido cerebral espessa resulta em uma nova gama de perguntas que podem ser feitas sobre as propriedades de grandes populações celulares em oposição às propriedades de células únicas ou grupos vizinhos de células. Para alcançar resultados bem-sucedidos, deve-se aderir rigorosamente ao protocolo CLARITY, pois há uma ampla gama de parâmetros que precisam ser considerados para reduzir a variância entre as amostras (por exemplo, percentual de clareza, informações de fluoresc?...

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Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.

Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

A técnica de clareza descrita pela primeira vez em 2013 é uma técnica de limpeza tecidual que permite a amostragem de maiores quantidades de células, vasos sanguíneos, de modo que mesmo proteínas como uma resolução celular única em fatias cerebrais grossas. Esta técnica permite o estudo de estruturas microscópicas intactas, tornando todo o cérebro transparente. Este protocolo é um simples chip e um pipeline simples para limpar tecidos.Esta técnica pode ser usada para limpar tecidos em outros sistemas, além de tecidos cerebrais. Para começar, sele o tubo e a tampa usando parafilme e puna dois furos na tampa. Em seguida, transfira gás nitrogênio do tanque usando um tubo flexível com cinco milímetros de diâmetro interno e uma agulha de calibre 19 conectada em sua extremidade.Comece a desgasear anexando o tubo ao tubo e permitindo a troca de gás por 30 minutos em temperatura ambiente. Retire o tubo e sele imediatamente os orifícios com argila modeladora. Em seguida, transfira os tubos selados de degas para um banho Celsius de 37 graus por 3 horas e meia para polimerizar a solução de hidrogel.Tire o cérebro do tubo. Usando lenços de laboratório, remova o hidrogel polimerizado ao redor do cérebro, garantindo que nenhum gel residual permaneça ligado à superfície do cérebro. Divida o cérebro em fatias grossas que contenham todas as áreas de interesse.Coloque as fatias na primeira solução de compensação e incubar a 37 graus Celsius com rotação a 70 RPM por 24 horas. Enquanto isso, prepare um tubo perfurado para colocar o cérebro. Coloque o tubo perfurado em um béquer preenchido com segunda solução de compensação em um dispositivo de agitação.Em seguida, coloque o cérebro no béquer e sele-o com papel alumínio para evitar branqueamento. Depois que o tecido se tornar transparente, transfira o cérebro para PBST em incubar a 37 graus Celsius com rotação a 70 RPM por 24 horas. Substitua a solução por PBST fresco e continue a incubação por mais 24 horas.Em seguida, transfira o cérebro para PBS em temperatura ambiente por 24 horas. Após 24 horas, remova o cérebro da PBS e transfira-o para uma solução de correspondência de índices refrativos. Incubar o cérebro a 37 graus Celsius durante a noite.Primeiro, coloque a amostra no meio do slide. Usando cola quente, crie paredes nas bordas do escorregador, quase tão alto quanto o tecido. Certifique-se de deixar uma pequena lacuna em um dos cantos.À medida que a camada de cola quente se aproxima da altura da fatia cerebral, aplique uma a duas gotas da solução de correspondência de índice refrativo na amostra para umedecer a superfície superior e evitar a formação de bolhas. Enquanto a cola quente ainda é líquida, sele a parte superior com um deslizamento de tampa, colocando-a o mais uniformemente possível e, em seguida, encha a câmara com a solução de correspondência de índice refrativo. Feche a lacuna com cola quente.Se as paredes de cola quente se estenderem além das bordas do slide, corte as bordas de extensão. Se um objetivo de imersão em óleo for usado para imagens, adicione mais dois a três milímetros de cola às paredes acima do deslizamento da tampa para manter a solução de imersão. Após este protocolo, o tecido cerebral será limpo.Fatias cerebrais claras foram preparadas usando este protocolo para visualizar populações de astrócitos e neurônios na região ca1 do hipocampo de camundongos. Todos os astrócitos expressaram tdTomato e neurônios excitatórios expressaram H2B-GFP em seus núcleos. A câmara preparada para o tecido esclarecido foi ideal para imagens sob um microscópio de dois fótons ou confocal.Usando um microscópio de dois fótons, mais de 300 astrócitos foram observados em uma seção desmatada da região ca1 do hipocampo do rato. Os astrócitos hipocampais em células vermelhas e piramidais, somata em verde eram visíveis e grossos, tecido transparente representando a proximidade espacial entre esses dois tipos de células. Usando um microscópio confocal a laser de varredura, feixes axonais de neurônios excitatórios foram rastreados por todo um hemisfério.Feixes verdes foram rastreados do hipocampo dorsal em direção aos corpos super mamillários. Os feixes vermelhos foram rastreados dos corpos mamillary em direção à sua origem no hipocampo de ventilação. Fatores como temperatura, concentrações e tempo de incubação influenciaram o resultado do procedimento de clareza.Portanto, a precisão em cada etapa do protocolo é vital para o sucesso de alcançar tecido claro. Usando essa técnica, medimos as distâncias entre neurônios e astrócitos em várias estruturas cerebrais. Este protocolo permitiu a análise de duas a três ordem de magnitude mais células do que em estudos anteriores.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

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Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...