Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Projektet har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 803589), Israel Science Foundation (ISF-anslag nr 1815/18) och Kanada-Israel-bidragen (CIHR-ISF, anslag nr 2591/18). Vi tackar Nechama Novick för att han kommenterade hela manuskriptet.

Experimentella protokoll godkändes av Hebrew University Animal Care and Use Committee och uppfyllde riktlinjerna från National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Viral vektortransduktion
OBS: Viral vektortransduktion används för att uttrycka fluoroforer i hjärnan.
<ol><li>Använd en atlas (t.ex. Allen Brain Atlas) för att hitta relevant samordning av målområdet. OBS: 3D-atlaser finns online (t.ex. h...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Vävnadsrensningsmetoder utgör ett revolutionerande verktyg inom hjärnforskningen och inbjuder till frågor som inte tidigare kunde ha ställts. Från att rikta in sig på egenskaperna hos en liten grupp celler, en enda cell eller till och med en enda synaps, möjliggör CLARITY nu inriktning på totala cellpopulationer eller långväga anslutningsfunktioner genom att använda relevanta fluoroforer.
Resultatet av kombinationen av fluoroforuttryck och CLARITY-procedur är inte binärt; många...

Under de senaste åren har kunskapen om astrocytfunktion och hur de interagerar med neuronala kretsar ökat dramatiskt. Astrocyter kan påverka plasticitet 1,2, hjälpa till med neuronal återhämtning efter skada 3,4 och till och med inducera de novo neuronal potentiering, med nyligen genomförda studier som visar vikten av astrocyter vid minnesförvärv och belöning, som tidigare betraktades som rent neuronala funktioner 5,6,7 . En egenskap av särskilt intresse för astrocytforskning är cellernas rumsliga arrangemang, som upprätthåller unika rumsliga organisationer i hippocampus och andra hjärnstrukturer 8,9,10. Till skillnad från de neuronala dendriterna som sammanflätas mellan cellsomater, bor hippocampala astrocyter visuellt urskiljbara territorier med liten överlappning mellan deras processer, vilket skapar distinkta domäner 8,11,12,13. Bevisen som stöder astrocyternas deltagande i neuronala kretsar stöder inte bristen på detaljerad anatomisk beskrivning av sådana populationer och neuronerna i deras domäner14.
Virala vektortransduktionsförfaranden, tillsammans med transgena djur (TG), har populariserats som en verktygssats för att undersöka hjärnstrukturer, funktioner och cellinteraktioner15,16. Användningen av olika promotorer möjliggör inriktning av specifika celler enligt deras genetiska egenskaper, aktiveringsnivåer17,18 eller projektionsmål. Olika virus kan uttrycka olika färgade fluoroforer i olika populationer. Ett virus kan kombineras med det endogena uttrycket av fluoroforer i TG, eller TG-djur kan användas utan behov av virus. Dessa tekniker används ofta för neuronal märkning, och vissa laboratorier har börjat använda dem med modifieringar specialiserade för att rikta in sig på andra celltyper, såsom astrocyter 5,9,19.
CLARITY-tekniken, som först beskrevs 2013 20,21, möjliggör studier av tjocka hjärnskivor genom att göra hela hjärnan transparent samtidigt som de mikroskopiska strukturerna lämnas intakta. Genom att kombinera de två metoderna - viral vektortransduktion och vävnadsrensning - är möjligheten att undersöka de rumsliga interaktionerna mellan olika celltyppopulationer nu tillgänglig. De flesta astrocyt-neuroninteraktionsstudier utfördes på tunna hjärnskivor, vilket resulterade i bilder av ofullständiga astrocyter på grund av deras stora domäner, vilket radikalt begränsade antalet analyserade celler. Användningen av CLARITY-tekniken möjliggör encellsupplösningskarakterisering av cellpopulationer i storskaliga volymer samtidigt. Avbildning av fluorescerande märkta cellpopulationer i klara hjärnor ger inte synaptisk upplösning men möjliggör grundlig karakterisering av de rumsliga interaktionerna mellan astrocyter och en mängd olika neuronala celltyper.
Av den anledningen utnyttjade vi dessa toppmoderna tekniker för att undersöka egenskaperna hos astrocyter i hela dorsal CA1, avbildning av all lamina (Stratum Radiatum, pyramidal layer och Stratum Oriens). Vi mätte tiotusentals astrocyter (med viral penetrans på >96%5) och analyserade därmed informationen från hela den astrocytiska befolkningen runt CA1. Med effektiv penetrans av neuronala markörer kunde vi registrera interaktionerna mellan hela populationen av CA1-astrocyter och de fyra typerna av neuronala celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hämmande neuroner och excitatoriska pyramidala celler9.
Flera experiment utfördes med användning av en kombination av fluorescens från TG-djur och olikfärgade virusvektorer (alla hämmande celler), medan andra (excitatoriska) använde två virala vektorer som uttryckte olika fluoroforer under olika promotorer9. Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll, inklusive märkning av önskade celler i hjärnan, vilket gör hjärnan transparent med hjälp av ett modifierat CLARITY-förfarande, samt avbildning och analys av kompletta hjärnstrukturer, med hjälp av olika procedurer och programvara.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

Genom att kombinera viral vektortransduktion och vävnadsrensning med hjälp av CLARITY-metoden kan man samtidigt undersöka flera typer av hjärnceller och deras interaktioner. Viral vektortransduktion möjliggör märkning av olika celltyper i olika fluorescensfärger inom samma vävnad. Celler kan identifieras genetiskt genom aktivitet eller projektion. Med hjälp av ett modifierat CLARITY-protokoll har den potentiella provstorleken för astrocyter och neuroner ökat med 2-3 storleksordningar. Användningen av CLARITY möjliggör avbildning av kompletta astrocyter, som är för stora för att passa i sin helhet i skivor, och undersökning av somata med alla sina processer. Dessutom ger det möjlighet att undersöka den rumsliga interaktionen mellan astrocyter och olika neuronala celltyper, nämligen antalet pyramidala neuroner i varje astrocytisk domän eller närheten mellan astrocyter och specifika hämmande neuronpopulationer. Detta dokument beskriver i detalj hur dessa metoder ska tillämpas.

Framgångsrik rensning av tjocka hjärnvävnadsskivor resulterar i ett nytt antal frågor som kan ställas angående egenskaperna hos stora cellpopulationer i motsats till egenskaperna hos enskilda celler eller angränsande grupper av celler. För att uppnå framgångsrika resultat bör man strikt följa CLARITY-protokollet, eftersom det finns ett brett spektrum av parametrar som måste beaktas för att minska variansen mellan prover (t.ex. procentandel av klarhet, fluorescensinformation, svullnadsparametrar).
<p cla...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Genom att kombinera viral vektortransduktion och hjärnrensning med hjälp av CLARITY-metoden kan man undersöka ett stort antal nervceller och astrocyter samtidigt.

Undersökning av rumslig interaktion mellan astrocyter och neuroner i rensade hjärnor

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Klarhetstekniken som först beskrevs 2013 är en vävnadsrensningsteknik som möjliggör provtagningar av större mängder celler, blodkärl, så även proteiner en sådan enda cellupplösning i tjocka hjärnskivor. Denna teknik möjliggör studier av intakta mikroskopiska strukturer genom att göra hela hjärnan transparent. Detta protokoll är ett enkelt chip och en enkel pipeline för vävnadsklar.Denna teknik kan användas för att rensa vävnader i andra system förutom hjärnvävnader. För att börja, försegla röret och locket med parafilm och punktera två hål i locket. Överför sedan kvävgas från tanken med ett flexibelt rör med fem millimeter inre diameter och en 19 gauge nål ansluten i slutet.Börja avgasa genom att fästa röret på röret och tillåta gasutbyte i 30 minuter vid rumstemperatur. Lossa röret och försegla omedelbart hålen med modelleringslera. Överför sedan de degasförseglade rören till ett 37 grader Celsius bad i 3 1/2 timmar för att polymerisera hydrogellösningen.Ta ut hjärnan från röret. Använd laboratorieservetter, ta bort den polymeriserade hydrogelen runt hjärnan så att ingen kvarvarande gel förblir fäst vid hjärnans yta. Dela hjärnan i tjocka skivor som innehåller alla intressanta områden.Lägg skivorna i den första rensningslösningen och inkubera vid 37 grader Celsius med rotation vid 70 varv / min i 24 timmar. Under tiden förbereder du ett perforerat rör för att placera hjärnan. Lägg det perforerade röret i en bägare fylld med andra rensningslösning på en omrörningsanordning.Placera sedan hjärnan i bägaren och försegla den med aluminiumfolie för att förhindra blekning. När vävnaden blir transparent, överför hjärnan till PBST i inkubation vid 37 grader Celsius med rotation vid 70 RPM i 24 timmar. Byt ut lösningen med färsk PBST och fortsätt inkubationen i ytterligare 24 timmar.Överför sedan hjärnan till PBS vid rumstemperatur i 24 timmar. Efter 24 timmar, ta bort hjärnan från PBS och överför den till brytningsindex matchande lösning. Inkubera hjärnan vid 37 grader Celsius över natten.Placera först provet i mitten av bilden. Använd hett lim, skapa väggar på kanterna på bilden, nästan lika höga som vävnaden. Se till att lämna ett litet mellanrum i ett av hörnen.När det heta limskiktet närmar sig hjärnskivans höjd, applicera en till två droppar av brytningsindexmatchningslösningen på provet för att fukta den övre ytan och förhindra bubbelbildning. Medan det heta limet fortfarande är flytande, försegla toppen med en täckslip, placera den så jämnt som möjligt och fyll sedan kammaren med brytningsindexmatchningslösningen. Stäng klyftan med hett lim.Om de heta limväggarna sträcker sig utanför bildens gränser, skär de utsträckta kanterna. Om ett oljenedsänkningsmål används för avbildning, tillsätt ytterligare två till tre millimeter lim på väggarna ovanför täckglidningen för att behålla nedsänkningslösningen. Efter detta protokoll kommer hjärnvävnaden att rensas.Tydliga hjärnskivor framställdes med hjälp av detta protokoll för att visualisera populationer av astrocyter och neuroner i CA1-regionen av musflod hippocampus. Alla astrocyter uttryckte tdTomato och excitatoriska neuroner uttryckte H2B-GFP i sina kärnor. Kammaren förberedd för den klarade vävnaden var optimal för avbildning under ett två foton- eller konfokalmikroskop.Med hjälp av ett tvåfotonmikroskop observerades över 300 astrocyter i en rensad del av CA1-regionen i musens hippocampus. De hippocampala astrocyterna i röda och pyramidala celler, somata i grönt var synliga och tjocka, transparenta vävnader som representerade den rumsliga närheten mellan dessa två celltyper. Med hjälp av ett skanningslaserkonfokalmikroskop spårades axonala buntar från excitatoriska neuroner över en hel halvklot.Gröna buntar spårades från dorsal hippocampus mot supermamillära kroppar. De röda buntarna spårades från mamillärkropparna mot deras ursprung vid ventilen hippocampus. Faktorer som temperatur, koncentrationer och inkubationstid påverkade resultatet av tydlighetsförfarandet.Därför är exakthet i varje steg i protokollet avgörande för att lyckas uppnå klar vävnad. Med hjälp av denna teknik mäter vi avstånden mellan nervceller och astrocyter i flera hjärnstrukturer. Detta protokoll möjliggjorde analys av två till tre storleksordningar fler celler än i tidigare studier.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolering och odling av Mus Kortikala Astrocyter

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

Taktil konditionering och rörelse Analys av antenn provtagningsmetoder i honung Bin (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

En omvälvning Analys: Ett protokoll för att bedöma samspelet mellan CNS fagocyter och nervceller

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolering och RNA-extraktion av nervceller, makrofager och mikroglia från Larval zebrafiskar hjärnor

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Högupplöst 3D-avbildning av rabies virus infektion i Lösningsmedelsrensade hjärnvävnad

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisera och analysera intracellulär transport av organeller och andra laster i astrocyter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Etablering av en elektrofysiologisk plattform för modellering av ALS med regionalt specifika humana pluripotenta stamcellshärledda astrocyter och neuroner

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...