Name: investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı (hibe anlaşması No 803589), İsrail Bilim Vakfı (ISF hibe No. 1815/18) ve Kanada-İsrail hibeleri (CIHR-ISF, hibe No. 2591/18) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) finansman almıştır. Nechama Novic'e tüm el yazması hakkında yorum yaptığı için teşekkür ederiz.

Deneysel protokoller İbrani Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun yönergelerini karşıladı.
1. Viral vektör transdüksiyonu
NOT: Viral vektör iletimi, beyindeki floroforları eksprese etmek için kullanılır.
<ol><li>Hedef alanın ilgili koordinasyonunu bulmak için bir atlas (örneğin, Allen Beyin Atlası...

<ol>
	<li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+astrocytes+process+and+control+synaptic+information.">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li><li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease.">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li><li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema,+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model.">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).</li><li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema.">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li><li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement.">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li><li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+in+memory+function:+pioneering+findings+and+future+directions.">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li><li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits.">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons.">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li><li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human.">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915 (2016).</li><li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development.">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus.">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li><li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit-specialized+astrocytes:+transcriptomic,+proteomic,+morphological,+and+functional+evidence.">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval.">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo.">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences.">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li></ol>

Doku temizleme yöntemleri, beyin araştırmalarında devrim niteliğinde bir araç sunarak, daha önce sorulamayan soruları davet ediyor. Küçük bir hücre grubunun, tek bir hücrenin veya hatta tek bir sinapsın özelliklerini hedeflemekten, CLARITY artık ilgili floroforları kullanarak toplam hücre popülasyonlarının veya uzun menzilli bağlantı özelliklerinin hedeflenmesini sağlar.
Florofor ekspresyonu ve CLARITY prosedür kombinasyonunun sonucu ikili değildir; birçok faktör p...

Son yıllarda, astrosit fonksiyonu ve nöronal devrelerle nasıl etkileşime girdikleri bilgisi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Astrositler plastisiteyi etkileyebilir 1,2, nöronal yaralanma sonrası iyileşmeye yardımcı olabilir3,4 ve hatta astrositlerin hafıza edinimi ve ödülündeki önemini gösteren son çalışmalarla, daha önce tamamen nöronal fonksiyonlar olarak kabul edilen 5,6,7 . Astrosit araştırmalarında özellikle ilgi çekici bir özellik, hipokampus ve diğer beyin yapılarında benzersiz mekansal organizasyonları koruyan hücrelerin mekansal düzenlemesidir 8,9,10. Hücre somataları arasında iç içe geçen nöronal dendritlerin aksine, hipokampal astrositler, süreçleri arasında hafif örtüşme ile görsel olarak ayırt edilebilir bölgelerde yaşarlar ve farklı alanlar yaratırlar 8,11,12,13. Astrositlerin nöronal devrelere katılımını destekleyen kanıtlar, bu tür popülasyonların ve alanlarındaki nöronların ayrıntılı anatomik tanımının eksikliğini desteklememektedir14.
Viral vektör transdüksiyon prosedürleri, transgenik hayvanlarla (TG) birlikte, beyin yapılarını, fonksiyonlarını ve hücre etkileşimlerini araştırmak için bir araç seti olarak popülerleştirilmiştir15,16. Farklı promotörlerin kullanılması, spesifik hücrelerin genetik özelliklerine, aktivasyon seviyelerine17,18 veya projeksiyon hedeflerine göre hedeflenmesini sağlar. Farklı virüsler, farklı popülasyonlarda farklı renkli floroforları ifade edebilir. Bir virüs, TG'deki floroforların endojen ekspresyonu ile birleştirilebilir veya TG hayvanları virüslere ihtiyaç duymadan kullanılabilir. Bu teknikler nöronal işaretleme için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı laboratuvarlar bunları astrositler 5,9,19 gibi diğer hücre tiplerini hedeflemek için uzmanlaşmış modifikasyonlarla kullanmaya başlamıştır.
İlk olarak 201320,21'de tanımlanan CLARITY tekniği, mikroskobik yapıları sağlam bırakırken tüm beyni şeffaf hale getirerek kalın beyin dilimlerinin incelenmesini sağlar. İki yöntemi birleştirerek - viral vektör transdüksiyonu ve doku temizliği - farklı hücre tipi popülasyonları arasındaki uzamsal etkileşimleri inceleme seçeneği artık mevcuttur. Çoğu astrosit-nöron etkileşimi çalışması ince beyin dilimleri üzerinde gerçekleştirildi, bu da büyük alanları nedeniyle tamamlanmamış astrositlerin görüntüleriyle sonuçlandı ve böylece analiz edilen hücrelerin sayısını radikal bir şekilde kısıtladı. CLARITY tekniğinin kullanılması, aynı anda büyük ölçekli hacimlerde hücre popülasyonlarının tek hücreli çözünürlük karakterizasyonuna izin verir. Berrak beyinlerde floresan olarak etiketlenmiş hücre popülasyonlarının görüntülenmesi sinaptik çözünürlük sağlamaz, ancak astrositler ve çeşitli nöronal hücre tipleri arasındaki uzamsal etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesine izin verir.
Bu nedenle, astrositlerin dorsal CA1 boyunca özelliklerini araştırmak ve tüm laminaları (Stratum Radyatum, piramidal tabaka ve Stratum Oriens) görüntülemek için bu son teknoloji teknikleri kullandık. On binlerce astrositi ölçtük (viral penetransı >% 965 ile), böylece CA1 çevresindeki tüm astrositik popülasyonun bilgilerini analiz ettik. Nöronal belirteçlerin etkili penetransı ile, CA1 astrositlerinin tüm popülasyonu ile dört tip nöronal hücre-parvalbümin (PV), somatostatin (SST), VIP inhibitör nöronlar ve uyarıcı piramidal hücreler arasındaki etkileşimleri kaydedebiliriz9.
TG hayvanlarından floresan ve farklı renkli viral vektörlerin (tüm inhibitör hücreler) bir kombinasyonu kullanılarak çeşitli deneyler yapılırken, diğerleri (uyarıcı) farklı promotörler altında farklı floroforları ifade eden iki viral vektör kullandı9. Bu makale, beyinde istenen hücrelerin etiketlenmesi, değiştirilmiş bir CLARITY prosedürü kullanılarak beynin şeffaf hale getirilmesinin yanı sıra çeşitli prosedürler ve yazılımlar kullanarak tüm beyin yapılarının görüntülenmesi ve analiz edilmesi de dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV1-GFAP::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neuronal nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td>
			<td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td>
			<td></td>
			<td>viral vector used to detect neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide (2%)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#B7901</td>
			<td>Molecular weight - 61.83 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope, scanning, FV1000</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane, UK</td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 4%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RC147002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS</td>
			<td>SunJin lab</td>
			<td>#RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyGlass software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A software that allows 3D analysis of images using virtual reality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base 1 M</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>#002009239100</td>
			<td>Molecular weight - 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>#sc-29112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon microscope</td>
			<td>Neurolabware</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Initiator</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#011-19365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve doku temizlemeyi birleştirmek, aynı anda birkaç beyin hücresi türünü ve etkileşimlerini araştırmayı mümkün kılar. Viral vektör iletimi, aynı doku içinde farklı floresan renklerinde farklı hücre tiplerinin işaretlenmesini sağlar. Hücreler genetik olarak aktivite veya projeksiyon ile tanımlanabilir. Modifiye edilmiş bir CLARITY protokolü kullanarak, astrositlerin ve nöronların potansiyel örneklem büyüklüğü 2-3 büyüklük sırasına göre büyümüştür. CLARITY kullanımı, dilimler halinde bütününe sığmayacak kadar büyük olan astrositlerin tamamının görüntülenmesini ve somatanın tüm işlemleriyle incelenmesini sağlar. Ek olarak, astrositler ve farklı nöronal hücre tipleri arasındaki mekansal etkileşimi, yani her astrositik alandaki piramidal nöronların sayısını veya astrositler ile spesifik inhibitör nöron popülasyonları arasındaki yakınlığı araştırma fırsatı sunar. Bu makale, bu yöntemlerin nasıl uygulanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Kalın beyin dokusu dilimlerinin başarılı bir şekilde temizlenmesi, tek hücrelerin veya komşu hücre gruplarının özelliklerinin aksine, büyük hücre popülasyonlarının özellikleri hakkında sorulabilecek yeni bir dizi soruyla sonuçlanır. Başarılı sonuçlar elde etmek için, numuneler arasındaki varyansı azaltmak için dikkate alınması gereken çok çeşitli parametreler olduğundan (örneğin, berraklık yüzdesi, floresan bilgisi, şişlik parametreleri) CLARITY protokolüne kesinlikle uyulmalıd?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains at JoVE.com

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

İlk olarak 2013 yılında tanımlanan berraklık tekniği, daha büyük miktarlarda hücrenin, kan damarlarının, yani proteinlerin bile kalın beyin dilimlerinde tek bir hücre çözünürlüğü gibi örneklemelerini sağlayan bir doku temizleme tekniğidir. Bu teknik, tüm beyni şeffaf hale getirerek bozulmamış mikroskobik yapıların incelenmesini sağlar. Bu protokol, doku temizliği için basit bir çip ve basit bir boru hattıdır.Bu teknik, beyin dokularına ek olarak diğer sistemlerdeki dokuları temizlemek için kullanılabilir. Başlamak için, tüpü ve kapağı parafilm kullanarak kapatın ve kapaktaki iki deliği delin. Ardından, beş milimetre iç çapa sahip esnek bir boru ve ucuna bağlı 19 gauge iğne kullanarak azot gazını tanktan aktarın.Boruyu tüpe bağlayarak ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gaz değişimine izin vererek gaz gidermeye başlayın. Boruyu ayırın ve delikleri hemen modelleme kili ile kapatın. Daha sonra, hidrojel çözeltisini polimerize etmek için gaz giderici tüpleri 3 1/2 saat boyunca 37 santigrat derece banyoya aktarın.Beyni tüpten çıkarın. Laboratuvar mendilleri kullanarak, beynin etrafındaki polimerize hidrojeli çıkarın ve beynin yüzeyine bağlı kalan hiçbir artık jel kalmamasını sağlayın. Beyni tüm ilgi alanlarını içeren kalın dilimlere bölün.Dilimleri ilk temizleme çözeltisine koyun ve 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, beyni yerleştirmek için delikli bir tüp hazırlayın. Delikli tüpü, karıştırma cihazında ikinci temizleme çözeltisi ile doldurulmuş bir beherin içine koyun.Daha sonra beyni beherin içine yerleştirin ve ağartmayı önlemek için alüminyum folyo ile kapatın. Doku şeffaf hale geldikten sonra, beyni 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe halinde PBST'ye aktarın. Çözeltiyi taze PBST ile değiştirin ve inkübasyona 24 saat daha devam edin.Daha sonra beyni 24 saat boyunca oda sıcaklığında PBS'ye aktarın. 24 saat sonra, beyni PBS'den çıkarın ve kırılma indisi eşleştirme çözeltisine aktarın. Beyni bir gecede 37 santigrat derecede inkübe edin.İlk olarak, örneği slaytın ortasına yerleştirin. Sıcak tutkal kullanarak, slaytın kenarlarında, neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk bıraktığınızdan emin olun.Sıcak tutkal tabakası beyin diliminin yüksekliğine yaklaştıkça, üst yüzeyi nemlendirmek ve kabarcık oluşumunu önlemek için numune üzerine bir ila iki damla kırılma indisi eşleştirme çözeltisi uygulayın. Sıcak tutkal hala sıvı iken, üst kısmı bir kapak kayması ile kapatın, mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin ve ardından odayı kırılma indisi eşleştirme çözeltisi ile doldurun. Boşluğu sıcak tutkalla kapatın.Sıcak tutkal duvarları kızağın sınırlarının ötesine uzanıyorsa, uzatma kenarlarını kesin. Görüntüleme için bir yağ daldırma hedefi kullanılıyorsa, daldırma çözeltisini korumak için kapak kaymasının üzerindeki duvarlara iki ila üç milimetre daha yapıştırıcı ekleyin. Bu protokolden sonra beyin dokusu temizlenecektir.Fare hipokampusunun CA1 bölgesindeki astrosit ve nöron popülasyonlarını görselleştirmek için bu protokol kullanılarak berrak beyin dilimleri hazırlandı. Tüm astrositler tdTomato eksprese etti ve uyarıcı nöronlar çekirdeklerinde H2B-GFP eksprese etti. Berraklaştırılmış doku için hazırlanan oda, iki foton veya konfokal mikroskop altında görüntüleme için en uygunuydu.İki foton mikroskobu kullanılarak, fare hipokampusunun CA1 bölgesinin temizlenmiş bir bölümünde 300'den fazla astrosit gözlendi. Kırmızı ve piramidal hücrelerdeki hipokampal astrositler, yeşil renkli somata, bu iki hücre tipi arasındaki uzamsal yakınlığı temsil eden görünür ve kalın, şeffaf dokulardı. Taramalı bir lazer konfokal mikroskop kullanılarak, uyarıcı nöronlardan aksonal demetler tüm yarımküre boyunca izlendi.Yeşil demetler dorsal hipokampustan süper mamillary cisimlere doğru izlendi. Kırmızı demetler, mamillary cisimlerden havalandırma hipokampüsündeki kökenlerine doğru izlendi. Sıcaklık, konsantrasyonlar ve inkübasyon süresi gibi faktörler netlik prosedürünün sonucunu etkiledi.Bu nedenle, protokolün her adımındaki hassasiyet, berrak dokuya ulaşmanın başarısı için hayati öneme sahiptir. Bu tekniği kullanarak, çeşitli beyin yapılarındaki nöronlar ve astrositler arasındaki mesafeleri ölçüyoruz. Bu protokol, önceki çalışmalara göre iki ila üç büyüklük sırasına göre daha fazla hücrenin analizine izin verdi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

Dokunsal İklimlendirme Ve Bal Arısı yılında antennal Örnekleme Stratejileri Hareket Analizi (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...