Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

نشكر مركز PanorOmic Sciences ووحدة المجهر الإلكتروني ، كلية لي كا شينغ للطب ، جامعة هونغ كونغ ، للمساعدة في التصوير البؤري وقياس التدفق الخلوي. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من صندوق البحوث الصحية والطبية (HMRF و 17161272 و 19180392) التابع لمكتب الأغذية والصحة. الصندوق العام للبحوث (GRF، 17105420) التابع لمجلس المنح البحثية؛ Health@InnoHK، لجنة الابتكار والتكنولوجيا، حكومة منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة.

تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام الأنسجة البشرية الموضحة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة هونغ كونغ / هيئة المستشفيات في هونغ كونغ ويست كلاستر (UW13-364 و UW21-695). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى قبل جمع الأنسجة.
1. اشتقاق العضوية الرئة البشرية
<o...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

تصطف الشعب الهوائية البشرية مع ظهارة مجرى الهواء ، والمعروفة أيضا باسم الظهارة الهدبية الزائفة. أنواع الخلايا الرئيسية في ظهارة مجرى الهواء العلوي هي الخلايا الهدبية التي تمكن الحركة المنسقة لأهداب قمية لطرد المخاط والجسيمات المستنشقة من الشعب الهوائية ، والخلايا الكأسية التي تنتج وتف?...

أصبحت المواد العضوية أداة قوية وعالمية لنمذجة تطور الأعضاء في المختبر ودراسة البيولوجيا والمرض. عند استزراعها في وسط استزراع محدد بعامل النمو ، يمكن توسيع الخلايا الجذعية البالغة (ASC) من مجموعة متنوعة من الأعضاء في 3 أبعاد (3D) وتجميعها ذاتيا في مجموعات خلوية تشبه الأعضاء تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، تسمى المواد العضوية. أبلغ مختبر كليفرز عن اشتقاق أول عضوي مشتق من ASC ، عضوي معوي بشري ، في عام 2009 1,2. بعد ذلك ، تم إنشاء عضويات مشتقة من ASC لمجموعة متنوعة من الأعضاء والأنسجة البشرية ، بما في ذلك البروستاتا3،4 ، والكبد5،6 ، والمعدة7،8،9 ، والبنكرياس 10 ، والغدة الثديية 11 ، والرئة 12،13 . احتفظت هذه المواد العضوية المشتقة من ASC بالخصائص الخلوية والهيكلية والوظيفية الحرجة للعضو الأصلي وحافظت على الاستقرار الجيني والمظهري في ثقافة التوسع طويلة الأجل14,15.
يمكن أيضا اشتقاق المواد العضوية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلية الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS)16. في حين أن المواد العضوية المشتقة من PSC تستغل آليات تطوير الأعضاء لإنشائها ، يمكن إجبار ASCs على تكوين عضويات عن طريق إعادة بناء الظروف التي تحاكي مكانة الخلايا الجذعية أثناء التجديد الذاتي للأنسجة الفسيولوجية أو إصلاح الأنسجة. تعد المواد العضوية المشتقة من PSC نماذج مواتية لاستكشاف التطور والتكوين العضوي ، وإن كانت غير قادرة على الوصول إلى مستوى النضج المماثل للعضويات المشتقة من ASC. حالة النضج الشبيهة بالجنين للعضويات المشتقة من PSC ، والتعقيد لإنشاء هذه المواد العضوية تمنع بشكل كبير تطبيقاتها الواسعة لدراسة البيولوجيا وعلم الأمراض في الأنسجة الناضجة.
تصطف القناة التنفسية البشرية ، من الأنف إلى القصيبات الطرفية ، مع ظهارة مجرى الهواء ، وتسمى أيضا الظهارة الهدبية الزائفة الطبقية ، والتي تتكون من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا ، أي الخلايا الهدبية ، والخلية الكأسية ، والخلية القاعدية ، وخلية النادي. أنشأنا عضوي الرئة البشري المشتق من ASC من أنسجة الرئة البشرية بالتعاون مع مختبر Clevers12,13. يتم توسيع هذه المواد العضوية الرئوية على التوالي في وسط التوسع لأكثر من عام. تختلف المدة الدقيقة بين الخطوط العضوية المختلفة التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ظهارة مجرى الهواء الأصلي ، فإن هذه المواد العضوية الرئوية القابلة للتوسيع على المدى الطويل ليست ناضجة بما فيه الكفاية لأن الخلايا الهدبية ، وهي مجموعة الخلايا الرئيسية في مجرى الهواء البشري ، ممثلة تمثيلا ناقصا في هذه المواد العضوية الرئوية. وهكذا ، قمنا بتطوير بروتوكول تمايز قريب وأنشأنا عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ ظاهريا مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء إلى مستوى شبه فسيولوجي.
هنا نقدم بروتوكول فيديو لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

عدم وجود نموذج قوي في المختبر للظهارة التنفسية البشرية يعيق فهم بيولوجيا وأمراض الجهاز التنفسي. نحن نصف بروتوكولا محددا لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من الخلايا الجذعية البالغة في أنسجة الرئة وتحفيز التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة. ثم يتم توسيع العضوية الرئوية على التوالي لأكثر من 1 سنة مع استقرار عالي، في حين يتم استخدام العضوية مجرى الهواء المتمايزة لمحاكاة مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء البشري إلى مستوى شبه فسيولوجي. وبالتالي ، فإننا نؤسس نموذجا عضويا قويا لظهارة مجرى الهواء البشري. إن التوسع طويل الأجل في عضويات الرئة وعضويات مجرى الهواء المتمايزة يولد مصدرا مستقرا ومتجددا ، مما يمكن العلماء من إعادة بناء وتوسيع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري في أطباق الاستزراع. يوفر نظام الرئة العضوية البشرية نموذجا فريدا ونشطا من الناحية الفسيولوجية في المختبر لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسة التفاعل بين الفيروس والمضيف ، واختبار الأدوية ، ونمذجة الأمراض.

يتيح هذا البروتوكول اشتقاق عضويات الرئة البشرية بمعدل نجاح مرتفع. يتم فرم أنسجة الرئة البشرية الطازجة إلى قطع صغيرة ، ثم تتحلل مع الكولاجيناز. يتم تضمين الخلايا المفردة الناتجة في مصفوفة الطابق السفلي ويتم تحضينها في وسط التوسع العضوي الرئوي مع استكمال مزيج من العوامل المتخصصة لنمو الخل?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

يقدم البروتوكول طريقة لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ بأمانة ظهارة مجرى الهواء البشري.

إنشاء عضويات الرئة البشرية والتمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

نحن نقدم طريقة لإنشاء الثقافة العضوية لظهارة مجرى الهواء البشري في لوحات الثقافة. نحن نستمد عضوي الرئة البشرية مباشرة من أنسجة الرئة الأولية بكفاءة عالية. يتم توسيع عضوي الرئة البشري المشتق بشكل ثابت لأكثر من عام واحد ، ويسمح بروتوكول التمايز القريب بتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة التي يمكنها محاكاة ظهارة مجرى الهواء البشري بأمانة إلى مستوى فسيولوجي قريب.لذلك ، يسمح نظام الاستزراع للعلماء بإعادة بناء وتوسيع ظهارة مجرى الهواء البشري في ألواح الثقافة. إظهار الإجراء سيكون مان تشون تشيو وييفي يو ، طلاب الدكتوراه في مختبرنا لبدء عزل الخلايا من أنسجة الرئة البشرية للثقافة العضوية 3D ، وقطع أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة ملليمتر واحد مع مشرط معقم وغسل قطع الأنسجة مع 10 ملليلتر من الوسط القاعدي البارد. الطرد المركزي للأنسجة في 400 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية والتخلص من supernatant قبل تعليق الكريات في ثمانية ملليلتر من الوسط القاعدي المكمل بالكولاجيناز بتركيز نهائي قدره ملليغرام لكل ملليلتر.ثم ، هضم قطع الأنسجة عن طريق هز الأنبوب عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30 إلى 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم ، ماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة باستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر لقص قطع الأنسجة المهضومة. ثم قم بتصفية التعليق باستخدام مصفاة 100 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر.استعادة ونقل قطع الأنسجة من المصفاة إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر مع الوسط القاعدي. لإنهاء عملية الهضم ، أضف مصل البقر الجنيني إلى التدفق إلى تركيز نهائي قدره 2٪ ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من الوسط القاعدي كما هو موضح من قبل. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الكريات في 80 إلى 160 ميكرولتر من وسط مصفوفة الطابق السفلي البارد ووضع الأنابيب على الجليد.بعد ذلك ، قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق على كل بئر من لوحة ثقافة التعليق 24 بئرا التي تم تسخينها مسبقا. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. اسمح لمصفوفة الطابق السفلي بالتصلب وتشكيل قطرة.بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من وسط توسع عضويات الرئة البشرية مع خمسة نانومولات من heregulin-beta 1 إلى كل بئر واحتضن اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. بعد ثلاثة أيام ، قم بإزالة الوسط القديم مع الحفاظ على القطرة سليمة وأضف الوسط الطازج بعناية. بعد 10 إلى 14 يوما من المرور ، راقب المواد العضوية تحت المجهر وتأكد من عدم تضمين المواد العضوية بكثافة خلايا عالية جدا.لتمرير المواد العضوية الرئوية مع القص ، قم بكسر القطرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل بطرف ملليلتر واحد. ثم ، انقل المواد العضوية مع الوسط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر واضبط الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام وسط قاعدي بارد. قم بالطرد المركزي للأنبوب بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وتخلص من السوبرناتانت ، واغسل المواد العضوية ب 10 ملليلتر من الوسط القاعدي البارد.ثم ، أعد تعليق المواد العضوية في ملليلترين من الوسط القاعدي البارد وقصها إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور. بعد ذلك ، أضف الوسط القاعدي إلى حجم إجمالي قدره 10 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي قبل إعادة تعليق الشظايا العضوية بمصفوفة قبو باردة كافية لتمكين التوسع من 1: 3 إلى 1: 5 ووضع الأنابيب على الجليد. قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا للاحتضان عند 37 درجة مئوية للسماح لمصفوفة الطابق السفلي بالتصلب لمدة 10 إلى 15 دقيقة.في وقت لاحق ، أضف 500 ميكرولتر من وسط توسع الرئة العضوي إلى كل بئر واحتضنها في حاضنة زراعة الخلايا. تحديث الوسط كل ثلاثة أيام وتمرير المواد العضوية كل أسبوعين. لتمرير عضويات الرئة مع التربسينات ، أعد تعليق عضويات الرئة التي تم حصادها في ملليلتر واحد من إنزيم التفكك.احتضن العضو العضوي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ثم ، أضف ملليلتر واحد من الوسط القاعدي إلى الأنبوب وقص المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. تحقق من حجم القطع العضوية تحت المجهر عند تكبير 100X قبل إنهاء عملية الهضم باستخدام 40 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني.قم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام الوسط القاعدي وأجهزة الطرد المركزي قبل إعادة تعليق القطع العضوية في مصفوفة قبو باردة بحجم يكفي للمرور بنسبة 1: 5 إلى 1: 10. في وقت لاحق ، قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا وقم بزراعة اللوحة كما هو موضح من قبل. لتوليد 3D الهواء العضوية، احتضان العضوية الرئة في وسط التوسع لمدة سبعة إلى 10 أيام بعد المرور عن طريق القص الميكانيكي.ثم ، استبدل وسط التمدد بوسط تمايز قريب واحتضن المواد العضوية في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 14 يوما ، تخلص من الوسط في كل بئر وأضف المخزن المؤقت للخلية لحصاد المجرى الهوائي العضوي المتمايز لاستخراج الحمض النووي الريبي والكشف عن التعبير الجيني الخلوي بواسطة فحص RT-qPCR. قبل احتضان الإدخالات في حاضنة زراعة الخلايا مع 250 و 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية للوحة 24 بئرا ، على التوالي.ثم ، أضف ملليلتر واحد من الوسط القاعدي إلى الأنبوب وماصة لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية في خلايا مفردة. راقب الخلايا تحت المجهر قبل إنهاء عملية الهضم باستخدام 40 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرون إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر ونقل تعليق الخلية المصفى إلى أنبوب 15 ملليلتر.قم بتعبئة التعليق بوسط قاعدي إلى حجم إجمالي يبلغ 10 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الكريات التي تم جمعها من 24 قطرة في 1 إلى 2.5 ملليلتر من وسط تمدد الرئة العضوي ، اعتمادا على كثافة الخلية. احسب عدد الخلايا التي تحتوي على عداد الخلايا تحت المجهر ، ثم اضبط تركيز الخلية على 1.3 في 10 إلى ستة لكل ملليلتر لإدراج 24 بئرا.قم بإزالة الوسط القاعدي من الغرف العلوية والسفلية قبل إضافة 500 ميكرولتر من وسط التمدد في الغرفة السفلية. بذور 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا أعدت في وقت سابق على الغرفة القمية من إدراج 24 بئرا واحتضانها. بعد يومين ، استبدل وسط التمدد بوسط تمايز قريب في كل من الغرفة القمية والسفلية للوحة.احتضن المواد العضوية لمدة 14 يوما وقم بتحديث الوسط كل ثلاثة أيام. قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة كل يوم باستخدام نظام قياس المقاومة الكهربائية. في الصورة الميكروفوتوغرافية التمثيلية ، يمكن رؤية خلايا الرئة المعزولة حديثا مضمنة في مصفوفة الغشاء السفلي لعامل النمو المنخفض من النوع الثاني.ظهرت المواد العضوية الكيسية ونمت مع مرور الوقت. يتم عرض عضويات الرئة بعد المقطع الرابع هنا. في غضون ساعتين من القص الميكانيكي ، شكلت الشظايا العضوية المضمنة في مستخلص الغشاء السفلي المجالات الكيسية.أكدت الصورة الدقيقة لنفس الحقل في اليوم الخامس نمو العضوية بمرور الوقت. كانت الخلايا العضوية المتوسعة تؤوي جميع أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية الأربعة في مجرى الهواء ، بما في ذلك الخلايا الهدبية الإيجابية ACCTUB أو FOXJ1 الإيجابية ، والخلية القاعدية الإيجابية P63 ، وخلية النادي الإيجابية CC10 ، وخلية الكأس الإيجابية MUC5AC في حالة سابقة لأوانها. طورت المواد العضوية المحتضنة في وسط التمايز التوسعي والتمايز القريب مورفولوجيا متميزة بمرور الوقت.بعد أسبوعين من التمايز في وسط التمايز القريب ، كانت الأهداب المتحركة ملحوظة في كل عضوي. ولوحظ أن الاضطرابات الهضمية الضرب بشكل متزامن دفعت حطام الخلية داخل التجويف العضوي ودارت بها في اتجاه واحد لإزالة الجسيمات المستنشقة. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن المواد العضوية المتباينة تستوعب أربعة أنواع من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في التمايز القريب ووسط التمدد.بعد أسبوعين من التمايز ، طورت عضويات مجرى الهواء 2D حاجزا ظهاريا سليما. تم إجراء فحص انسداد ديكستران لتقييم سلامة الحاجز الظهاري المتشكل في عضويات مجرى الهواء 2D. تحتوي المواد العضوية 2D على خلايا هدبية وفيرة.يوفر الجهاز العضوي الرئوي القابل للتوسيع على المدى الطويل والجهاز العضوي المتمايز في مجرى الهواء نظاما نموذجيا نشطا من الناحية الفسيولوجية وعالميا لدراسة بيولوجيا الجهاز التنفسي وعلم الأمراض ، بما في ذلك COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

عزل وثقافة الخلايا التحمية الناضجة البشرية باستخدام الثقافات الكلية للأغشية الناضجة (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

إنشاء والتلاعب الجيني من الأورجانويدات مورين الكبدية

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

منصة عالية الإنتاجية للثقافة والتصوير 3D من المواد العضوية

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

إنشاء عضويات بطانة الرحم 3D من رحم الفأر

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...