Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Vi takker Center for PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Det Medicinske Fakultet, University of Hong Kong, for hjælp til konfokal billeddannelse og flowcytometri. Dette arbejde blev delvist støttet af midler fra Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) fra Food and Health Bureau; Forskningsrådets Generelle Forskningsfond (GRF, 17105420) og Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, regeringen i Hong Kong Special Administrative Region.

Alle eksperimenter ved hjælp af humant væv beskrevet heri blev godkendt af Institutional Review Board ved University of Hong Kong / Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 og UW21-695). Informeret samtykke blev indhentet fra patienter før vævsindsamling.
1. Afledning af human lungeorganoid
<ol><li>Forberedelse af eksperimentelle materialer<ol>
<li>Forbered basalt medium ved at supplere avanceret DMEM / F12-medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml pen...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

De menneskelige luftveje er foret med luftvejsepitelet, også kendt som det pseudostratificerede cilierede epitel. De vigtigste celletyper i det øvre luftvejsepitel er cilierede celler, der muliggør koordineret bevægelse af deres apikale cilier for at udvise slim og indåndede partikler fra luftvejene, bægerceller, der producerer og udskiller slim, og basalceller, der linjer kældermembranen og er impliceret i regenerering. I de små luftveje, såsom bronchioler, indeholder kuboidale luftvejsepitelet sekretoriske klu...

Organoider er blevet et robust og universelt værktøj til in vitro modellering af organudvikling og studere biologi og sygdom. Når de dyrkes i et vækstfaktordefineret kulturmedium, kan voksne stamceller (ASC) fra en række organer udvides i 3-dimension (3D) og selvsamles til organlignende cellulære klynger sammensat af flere celletyper, kaldet organoider. Clevers laboratorium rapporterede afledningen af den første ASC-afledte organoid, human intestinal organoid, i 2009 1,2. Derefter er ASC-afledte organoider blevet etableret for en række menneskelige organer og væv, herunder prostata 3,4, lever 5,6, mave 7,8,9, bugspytkirtel10, brystkirtel11 og lunge 12,13 . Disse ASC-afledte organoider bevarede det oprindelige organs kritiske cellulære, strukturelle og funktionelle egenskaber og opretholdt genetisk og fænotypisk stabilitet i langsigtet ekspansionskultur 14,15.
Organoider kan også stamme fra pluripotente stamceller (PSC), herunder embryonale stamceller (ES) celler og induceret pluripotent stamcelle (iPS)16. Mens PSC-afledte organoider udnytter mekanismerne for organudvikling til deres etablering, kan ASC'er tvinges til at danne organoider ved at genopbygge forhold, der efterligner stamcelleniche under fysiologisk vævs selvfornyelse eller vævsreparation. PSC-afledte organoider er gunstige modeller til at udforske udvikling og organogenese, omend de ikke er i stand til at nå det sammenlignelige modningsniveau for ASC-afledte organoider. Den fosterlignende modningsstatus for PSC-afledte organoider og kompleksiteten til etablering af disse organoider forhindrer i væsentlig grad deres brede anvendelser til at studere biologi og patologi i modne væv.
Det menneskelige luftveje, fra næse til terminal bronchiole, er foret med luftvejsepitelet, også kaldet det pseudostratificerede cilierede epitel, som består af fire hovedcelletyper, dvs. cilieret celle, bægercelle, basalcelle og klubcelle. Vi etablerede den ASC-afledte humane lungeorganoid fra humant lungevæv i samarbejde med Clevers' laboratorium12,13. Disse lungeorganoider udvides fortløbende i ekspansionsmediet i over et år; den nøjagtige varighed varierer mellem forskellige organoidlinjer opnået fra forskellige donorer. Sammenlignet med det indfødte luftvejsepitel er disse langsigtede udvidelige lungeorganoider imidlertid ikke modne nok, da cilierede celler, den største cellepopulation i de menneskelige luftveje, er underrepræsenteret i disse lungeorganoider. Således udviklede vi en proksimal differentieringsprotokol og genererede 3D- og 2D-luftvejsorganoider, der morfologisk og funktionelt phenokopierer luftvejsepitelet til et næsten fysiologisk niveau.
Her leverer vi en videoprotokol til at udlede humane lungeorganoider fra det primære lungevæv, udvide lungeorganoiderne og inducere proksimal differentiering for at generere 3D- og 2D-luftvejsorganoider.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

Manglen på en robust in vitro-model af det humane respiratoriske epitel hindrer forståelsen af åndedrætssystemets biologi og patologi. Vi beskriver en defineret protokol til at udlede humane lungeorganoider fra voksne stamceller i lungevævet og inducere proksimal differentiering for at generere modne luftvejsorganoider. Lungeorganoiderne udvides derefter fortløbende i over 1 år med høj stabilitet, mens de differentierede luftvejsorganoider bruges til morfologisk og funktionelt at simulere humant luftvejsepitel til et næsten fysiologisk niveau. Således etablerer vi en robust organoidmodel af det menneskelige luftvejsepitelet. Den langsigtede udvidelse af lungeorganoider og differentierede luftvejsorganoider genererer en stabil og vedvarende kilde, der gør det muligt for forskere at rekonstruere og udvide de menneskelige luftvejsepitelceller i kulturretter. Det humane lungeorganoidsystem giver en unik og fysiologisk aktiv in vitro-model til forskellige applikationer, herunder undersøgelse af virus-værtsinteraktion, lægemiddeltest og sygdomsmodellering.

Denne protokol muliggør afledning af humane lungeorganoider med en høj succesrate. Frisk humant lungevæv hakkes i små stykker og nedbrydes derefter med collagenase. De resulterende enkeltceller indlejres i kældermatrixen og inkuberes i lungeorganoidekspansionsmediet suppleret med en cocktail af nichefaktorer til udvækst af epitelstamceller (trin 1.1.2). Figur 1 viser mikrofotografiet af frisk isolerede lungeceller indlejret i reduceret vækstfaktor kældermembranmatrix Type 2 (BME; <st...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

Protokollen præsenterer en metode til at udlede humane lungeorganoider fra primære lungevæv, udvide lungeorganoiderne og inducere proksimal differentiering for at generere 3D- og 2D-luftvejsorganoider, der trofast phenocopy det menneskelige luftvejsepitele.

Etablering af humane lungeorganoider og proksimal differentiering for at generere modne luftvejsorganoider

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Vi introducerer en metode til at etablere organoidkulturen af human luftvejsepitelet i kulturplader. Vi udleder human lungeorganoid direkte fra primære lungevæv med høj effektivitet. Den afledte humane lungeorganoid udvides stabilt i over et år, og en proksimal differentieringsprotokol tillader generering af modne luftvejsorganoider, der trofast kan simulere det menneskelige luftvejsepitel til et næsten fysiologisk niveau.Derfor giver kultursystemet forskere mulighed for at rekonstruere og udvide det menneskelige luftvejsepitelet i kulturplader. Demonstration af proceduren vil være Man Chun Chiu og Yifei Yu, ph.d.-studerende i vores laboratorium For at begynde celleisoleringen fra humant lungevæv til 3D-organoidkultur skal du hakke lungevævene i en millimeter små stykker med en steril skalpel og vaske vævsstykkerne med 10 ml koldt basalmedium. Centrifuger vævene ved 400 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og kassér supernatanten, før pelleten genoplives i otte milliliter basalt medium suppleret med collagenase i en endelig koncentration på to milligram pr. Milliliter.Fordøje derefter vævsstykkerne ved at ryste røret ved 120 o / min i 30 til 40 minutter ved 37 grader Celsius. Efter fordøjelsen pipetteres op og ned 20 gange ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette til at forskyde de fordøjede vævsstykker. Derefter filtreres suspensionen med en 100 mikron sil i et 50 ml rør.Gendan og overfør vævsstykkerne fra silen til et 15 ml centrifugerør med basalmediet. For at afslutte fordøjelsen tilsættes føtalt bovint serum til gennemstrømningen til en slutkoncentration på 2% Centrifuger derefter røret og resuspender cellepillen i 10 ml basalmediet som beskrevet før. Efter centrifugering resuspenderes pelleten i 80 til 160 mikroliter koldt kældermatrixmedium og anbringes på is.Derefter dispenseres 40 mikroliter af suspensionen til hver brønd af en forvarmet 24-brønd suspensionskulturplade. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 10 til 15 minutter. Lad kældermatrixen størkne og danne en dråbe.Efter inkubation tilsættes 500 mikroliter humane lungeorganoider ekspansionsmedium suppleret med fem nanomolar af heregulin-beta 1 til hver brønd og inkuberer pladen i en cellekulturinkubator. Efter tre dage skal du fjerne det gamle medium, mens du holder dråben intakt og forsigtigt tilsættes frisk medium. Efter 10 til 14 dages passaging skal du observere organoiderne under et mikroskop og sikre, at organoiderne ikke er indlejret med en meget høj celletæthed.For at passere lungeorganoiderne med klipning skal du bryde dråberne ved at pipettere op og ned med en milliliter spids. Overfør derefter organoiderne sammen med mediet til et 15 ml centrifugerør og juster volumenet til 10 ml med et koldt basalmedium. Centrifuger røret ved 300 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius, kassér supernatanten, og vask organoiderne med 10 ml koldt basalmedium.Derefter resuspender organoiderne i to milliliter koldt basalmedium og forskyd i små stykker med en Pasteur-pipette. Derefter tilsættes basalt medium til et samlet volumen på 10 ml og centrifuger, inden organoidfragmenterne genoplives med en kold kældermatrix, der er tilstrækkelig til at muliggøre en 1: 3 til 1: 5 ekspansion og placere rørene på is. Dispenser 40 mikroliter organoid suspension i hver brønd af en forvarmet 24-brøndplade for at inkubere ved 37 grader Celsius for at tillade kældermatrixen at størkne i 10 til 15 minutter.Senere tilsættes 500 mikroliter lungeorganoidekspansionsmedium til hver brønd og inkuberes i en cellekulturinkubator. Opdater mediet hver tredje dag og passere organoiderne hver anden uge. For at passere lungeorganoider med trypsinisering, resuspend høstede lungeorganoider i en milliliter dissociationsenzym.Inkuber organoiden i et 37 grader celsius vandbad i tre til fem minutter. Derefter tilsættes en milliliter basalmedium til røret og forskydes organoiderne mekanisk ved at pipettere op og ned. Kontroller størrelsen af organoidstykker under et mikroskop ved 100X forstørrelse, før fordøjelsen afsluttes med 40 mikroliter føtalt bovint serum.Volumenet fyldes op til 10 ml med basalmedium og centrifuger, inden organoidstykkerne genopføres i en kold kældermatrix med et volumen, der er tilstrækkeligt til passage med et forhold på 1:5 til 1:10. Senere dispenseres 40 mikroliter organoidophæng i hver brønd af en 24-brønds plade og kultur pladen som demonstreret før. For at generere 3D-luftvejsorganoider skal lungeorganoiderne inkuberes i ekspansionsmediet i syv til 10 dage efter passage via mekanisk klipning.Udskift derefter ekspansionsmediet med proximalt differentieringsmedium og inkuber organoiderne i en cellekulturinkubator. Efter 14 dage kasseres mediet i hver brønd og tilsættes cellelysatbuffer for at høste den differentierede luftvejsorganoid til RNA-ekstraktion og påvisning af cellulær genekspression ved RT-qPCR-assay. Pre-inkubere indsatserne i cellekulturinkubatoren med 250 og 500 mikroliter af basalmediet i henholdsvis det øverste og nederste kammer i en 24-brøndplade.Derefter tilsættes en milliliter basalt medium til røret og pipetteres op og ned for at forskyde organoiderne i enkeltceller. Overhold cellerne under et mikroskop, før fordøjelsen afsluttes med 40 mikroliter føtalt bovint serum. Filtrer cellerne gennem en 40 mikron sil i et 50 ml rør og overfør den filtrerede cellesuspension til et 15 ml rør.Fyld suspensionen op med basalt medium til et samlet volumen på 10 ml. Efter centrifugering resuspend pelleten opsamlet fra 24 dråber i 1 til 2,5 ml lungeorganoid ekspansionsmedium afhængigt af celletætheden. Tæl antallet af celler med celletælleren under et mikroskop, og juster derefter cellekoncentrationen til 1,3 gange 10 til de seks pr. milliliter for 24-brøndindsatser.Fjern basalmediet fra de øverste og nederste kamre, inden du tilføjer 500 mikroliter ekspansionsmedium i bundkammeret. Frø 100 mikroliter cellesuspension fremstillet tidligere på det apikale kammer i 24-brøndindsatsen og inkuberer. Efter to dage udskiftes ekspansionsmediet med proximalt differentieringsmedium i både pladens apikale og nederste kammer.Inkuber organoiderne i 14 dage og opdater mediet hver tredje dag. Mål den transepiteliske elektriske modstand hver dag ved hjælp af et elektrisk modstandsmålingssystem. I den repræsentative mikrofotografi kan de friskisolerede lungeceller ses indlejret i reduceret vækstfaktor kældermembranmatrix type to.De cystiske organoider blev vist og vokset over tid. Lungeorganoiderne efter den fjerde passage er demonstreret her. Inden for to timer efter mekanisk klipning dannede de organoidfragmenter, der var indlejret i kældermembranekstraktet, de cystiske domæner.Mikrofotografiet af det samme felt på dag fem bekræftede organoid vækst over tid. De ekspanderende organoider indeholdt alle de fire store luftvejsepitelcelletyper, herunder ACCTUB-positive eller FOXJ1-positive cilierede celler, P63-positive basalceller, CC10-positive klubceller og MUC5AC-positive bægerceller i for tidlig tilstand. Organoiderne inkuberet i ekspansions- og proksimal differentieringsmediet udviklede tydelig morfologi over tid.Efter to ugers differentiering i det proksimale differentieringsmedium kunne bevægelige cilier ses i hver organoid. Det blev observeret, at den synkront slående celia kørte celleaffaldet inde i organoid lumen og hvirvlede dem ensrettet for at fjerne de indåndede partikler. Endvidere viste flowcytometrianalysen, at de differentierede organoider rummede fire luftvejsepitelcelletyper i proximal differentiering og ekspansionsmedium.Efter to ugers differentiering udviklede 2D-luftvejsorganoider en intakt epitelbarriere. Et dextran blokeringsassay blev udført for at vurdere integriteten af epitelbarrieren dannet i 2D luftvejsorganoider. 2D-organoiderne indeholdt rigelige cilierede celler.Den langsigtede udvidelige lungeorganoid og den differentierede luftvejsorganoid giver et fysiologisk aktivt og universelt modelsystem til undersøgelse af respiratorisk biologi og patologi, herunder COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokol for Lentiviral transduktion og nedstrøms analyse af Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Isolation og kultur af menneskelige modne adipocytter Ved hjælp af membran modne Adipocyte aggregatkulturer (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellet opløsning tredimensionel billeddannelse af intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Dyrkning af organoider fra Intestinal Villi Epithelium under dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering og genmanipulation af Murine Hepatocyte organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Brug af den præcisionsskårne lungeskive til at studere den kontraktile regulering af luftveje og intrapulmonal arteriel glat muskel

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En platform med høj kapacitet til kultur og 3D-billeddannelse af organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablering af 3D endometrieorganoider fra musens livmoder

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...