Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Wir danken dem Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, für die Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung und Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel aus dem Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) des Food and Health Bureau unterstützt; General Research Fund (GRF, 17105420) des Research Grants Council; und Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, die Regierung der Sonderverwaltungszone Hongkong.

Alle hier beschriebenen Experimente mit menschlichem Gewebe wurden vom Institutional Review Board der University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 und UW21-695) genehmigt. Vor der Gewebeentnahme wurde von den Patienten eine Einwilligung nach Aufklärung eingeholt.
1. Ableitung des menschlichen Lungenorganoids
<ol><li>Aufbereitung von Versuchsmaterialien<ol>
<li>Bereiten Sie das Basalmedium vor, indem Sie das fortgeschrittene DMEM/F12-Medium mit...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

Die menschlichen Atemwege sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, das auch als pseudostratifiziertes Flimmerepithel bekannt ist. Die Hauptzelltypen des Epithels der oberen Atemwege sind Flimmerzellen, die die koordinierte Bewegung ihrer apikalen Zilien ermöglichen, um Schleim und eingeatmete Partikel aus den Atemwegen auszustoßen, Becherzellen, die Schleim produzieren und absondern, und Basalzellen, die die Basalmembran auskleiden und an der Regeneration beteiligt sind. In den kleinen Atemwegen wie den Bronchiolen e...

Organoide sind zu einem robusten und universellen Werkzeug für die In-vitro-Modellierung der Organentwicklung und das Studium von Biologie und Krankheit geworden. Bei der Kultivierung in einem wachstumsfaktordefinierten Kulturmedium können adulte Stammzellen (ASC) aus einer Vielzahl von Organen in 3-dimensionalen (3D) erweitert und selbst zu organähnlichen Zellclustern zusammengesetzt werden, die aus mehreren Zelltypen, sogenannten Organoiden, bestehen. Das Labor von Clevers berichtete 2009 über die Ableitung des ersten von ASC abgeleiteten Organoids, des menschlichen Darmorganoids, 1,2. Danach wurden ASC-abgeleitete Organoide für eine Vielzahl von menschlichen Organen und Geweben etabliert, darunter Prostata 3,4, Leber5,6, Magen 7,8,9, Bauchspeicheldrüse 10, Brustdrüse 11 und Lunge 12,13 . Diese ASC-abgeleiteten Organoide behielten die kritischen zellulären, strukturellen und funktionellen Eigenschaften des nativen Organs bei und bewahrten die genetische und phänotypische Stabilität in der Langzeitexpansionskultur14,15.
Organoide können auch aus pluripotenten Stammzellen (PSC) gewonnen werden, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS)16. Während PSC-abgeleitete Organoide die Mechanismen der Organentwicklung für ihre Etablierung ausnutzen, können ASCs gezwungen werden, Organoide zu bilden, indem Bedingungen wieder aufgebaut werden, die die Stammzellnische während der physiologischen Gewebeselbsterneuerung oder Gewebereparatur nachahmen. PSC-abgeleitete Organoide sind günstige Modelle, um die Entwicklung und Organogenese zu erforschen, obwohl sie nicht in der Lage sind, den vergleichbaren Reifegrad von ASC-abgeleiteten Organoiden zu erreichen. Der fetale Reifungsstatus von PSC-abgeleiteten Organoiden und die Komplexität bei der Etablierung dieser Organoide verhindern im Wesentlichen ihre breiten Anwendungen für das Studium der Biologie und Pathologie in reifen Geweben.
Die menschlichen Atemwege, von der Nase bis zur terminalen Bronchiole, sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, auch pseudostratifiziertes Flimmerepithel genannt, das aus vier Hauptzelltypen besteht, d.h. Flimmerzelle, Kelchzelle, Basalzelle und Keulenzelle. Wir haben das von ASC abgeleitete humane Lungenorganoid aus menschlichem Lungengewebe in Zusammenarbeit mit dem Labor12,13 von Clevers etabliert. Diese Lungenorganoide werden im Expansionsmedium über ein Jahr lang nacheinander expandiert; Die genaue Dauer variiert zwischen verschiedenen Organoidlinien, die von verschiedenen Spendern erhalten wurden. Im Vergleich zum nativen Atemwegsepithel sind diese langfristig expandierbaren Lungenorganoide jedoch nicht reif genug, da Flimmerzellen, die Hauptzellpopulation in den menschlichen Atemwegen, in diesen Lungenorganoiden unterrepräsentiert sind. Daher entwickelten wir ein proximales Differenzierungsprotokoll und erzeugten 3D- und 2D-Atemwegsorganoide, die das Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau phänokopieren.
Hier stellen wir ein Videoprotokoll zur Verfügung, um menschliche Lungenorganoide aus dem primären Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

Das Fehlen eines robusten In-vitro-Modells des menschlichen respiratorischen Epithels behindert das Verständnis der Biologie und Pathologie des Atmungssystems. Wir beschreiben ein definiertes Protokoll, um menschliche Lungenorganoide aus adulten Stammzellen im Lungengewebe abzuleiten und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um reife Atemwegsorganoide zu erzeugen. Die Lungenorganoide werden dann nacheinander für über 1 Jahr mit hoher Stabilität expandiert, während die differenzierten Atemwegsorganoide verwendet werden, um das menschliche Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau zu simulieren. Damit etablieren wir ein robustes Organoidmodell des menschlichen Atemwegsepithels. Die langfristige Expansion von Lungenorganoiden und differenzierten Atemwegsorganoiden erzeugt eine stabile und erneuerbare Quelle, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die menschlichen Atemwegsepithelzellen in Kulturschalen zu rekonstruieren und zu erweitern. Das Organoidsystem der menschlichen Lunge bietet ein einzigartiges und physiologisch aktives In-vitro-Modell für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der Virus-Wirt-Interaktion, der Arzneimitteltests und der Krankheitsmodellierung.

Dieses Protokoll ermöglicht die Ableitung menschlicher Lungenorganoide mit hoher Erfolgsquote. Frisches menschliches Lungengewebe wird in kleine Stücke zerkleinert und dann mit Kollagenase zersetzt. Die resultierenden Einzelzellen werden in die Basalmatrix eingebettet und im Lungenorganoid-Expansionsmedium inkubiert, ergänzt durch einen Cocktail von Nischenfaktoren für das Auswachsen von epithelialen Stammzellen (Schritt 1.1.2). Abbildung 1 zeigt die Mikrofotografie von frisch isolierten...

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Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

Das Protokoll stellt eine Methode vor, um menschliche Lungenorganoide aus primärem Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren.

Etablierung menschlicher Lungenorganoide und proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Wir stellen eine Methode vor, um die organoide Kultur des menschlichen Atemwegsepithels in Kulturplatten zu etablieren. Wir leiten menschliches Lungenorganoid direkt aus primärem Lungengewebe mit hoher Effizienz ab. Die abgeleiteten menschlichen Lungenorganoide werden über ein Jahr lang stabil expandiert, und ein proximales Differenzierungsprotokoll ermöglicht die Erzeugung reifer Atemwegsorganoide, die das menschliche Atemwegsepithel bis zu einem nahezu physiologischen Niveau originalgetreu simulieren können.Daher ermöglicht das Kultursystem den Wissenschaftlern, das menschliche Atemwegsepithel in Kulturplatten zu rekonstruieren und zu erweitern. Man Chun Chiu und Yifei Yu, Doktoranden in unserem Labor demonstrieren Um mit der Zellisolierung aus menschlichem Lungengewebe für die 3D-Organoidkultur zu beginnen, zerkleinern Sie das Lungengewebe in ein Millimeter kleine Stücke mit einem sterilen Skalpell und waschen Sie die Gewebestücke mit 10 Milliliter kaltem Basalmedium. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 400 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in acht Milliliter Basalmedium, ergänzt mit Kollagenase, in einer Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter wieder suspendieren.Verdauen Sie dann die Gewebestücke, indem Sie den Schlauch bei 120 U / min für 30 bis 40 Minuten bei 37 Grad Celsius schütteln. Nach der Verdauung 20 Mal mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren, um die verdauten Gewebestücke zu scheren. Filtern Sie dann die Suspension mit einem 100-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Rohr.Die Gewebestücke werden vom Sieb zurückgewonnen und mit dem Basalmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Um die Verdauung zu beenden, fügen Sie dem Durchfluss fötales Rinderserum bis zu einer Endkonzentration von 2% hinzu, zentrifugieren Sie dann das Röhrchen und suspendieren Sie das Zellpellet wie zuvor beschrieben in 10 Milliliter des Basalmediums. Nach der Zentrifugation wird das Pellet in 80 bis 160 Mikroliter kaltem Grundmatrixmedium resuspendiert und die Röhrchen auf Eis gelegt.Als nächstes geben Sie 40 Mikroliter der Suspension an jede Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Suspensionskulturplatte ab. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren und ein Tröpfchen bilden.Nach der Inkubation fügen Sie 500 Mikroliter menschliches Lungenorganoid-Expansionsmedium, ergänzt mit fünf Nanomolar Heregulin-beta 1, zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie nach drei Tagen das alte Medium, während Sie das Tröpfchen intakt halten, und fügen Sie vorsichtig frisches Medium hinzu. Beobachten Sie die Organoide nach 10 bis 14 Tagen des Passierens unter einem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Organoide nicht mit einer sehr hohen Zelldichte eingebettet sind.Um die Lungenorganoide mit Scherung zu passieren, brechen Sie die Tröpfchen, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Spitze auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann die Organoide zusammen mit dem Medium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie das Volumen mit einem kalten Basalmedium auf 10 Milliliter ein. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Organoide mit 10 Millilitern kaltem Basalmedium.Dann suspendieren Sie die Organoide in zwei Millilitern kaltem Basalmedium und scheren Sie sie mit einer Pasteur-Pipette in kleine Stücke. Als nächstes fügen Sie Basalmedium zu einem Gesamtvolumen von 10 Millilitern hinzu und zentrifugieren, bevor Sie die Organoidfragmente mit einer kalten Basalmatrix auffüllen, die ausreicht, um eine 1: 3 bis 1: 5-Expansion zu ermöglichen, und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Dosieren Sie 40 Mikroliter Organoidsuspension in jeder Vertiefung einer vorerwärmten 24-Well-Platte, um bei 37 Grad Celsius zu inkubieren, damit die Kellermatrix für 10 bis 15 Minuten erstarren kann.Später fügen Sie 500 Mikroliter Lungenorganoid-Expansionsmedium zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator. Erfrischen Sie das Medium alle drei Tage und passieren Sie die Organoide alle zwei Wochen. Um Lungenorganoide mit Trypsinisierung zu passieren, resuspendieren Sie geerntete Lungenorganoide in einem Milliliter Dissoziationsenzym.Inkubieren Sie das Organoid in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für drei bis fünf Minuten. Dann fügen Sie einen Milliliter Basalmedium zum Rohr hinzu und scheren Sie die Organoide mechanisch, indem Sie nach oben und unten pipettieren. Überprüfen Sie die Größe der Organoidstücke unter einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung, bevor Sie die Verdauung mit 40 Mikrolitern fetalem Rinderserum beenden.Stellen Sie das Volumen mit Basalmedium und Zentrifuge auf 10 Milliliter auf, bevor Sie die Organoidstücke in einer kalten Kellermatrix mit einem Volumen aussetzen, das ausreicht, um mit einem Verhältnis von 1: 5 bis 1: 10 zu passieren. Später dosieren Sie 40 Mikroliter Organoidsuspension in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und kultivieren Sie die Platte wie zuvor gezeigt. Um 3D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, inkubieren Sie die Lungenorganoide im Expansionsmedium für sieben bis 10 Tage nach dem Passieren durch mechanische Scherung.Ersetzen Sie dann das Expansionsmedium durch proximales Differenzierungsmedium und inkubieren Sie die Organoide in einem Zellkulturinkubator. Nach 14 Tagen entsorgen Sie das Medium in jeder Vertiefung und fügen Sie Zelllysatpuffer hinzu, um das differenzierte Atemwegsorganoid für die RNA-Extraktion und den Nachweis der zellulären Genexpression durch RT-qPCR-Assay zu ernten. Vorinkubieren Sie die Einsätze im Zellkultur-Inkubator mit 250 bzw. 500 Mikrolitern des Basalmediums in der oberen und unteren Kammer einer 24-Well-Platte.Dann fügen Sie einen Milliliter Basalmedium in die Röhre hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die Organoide in einzelne Zellen zu scheren. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bevor Sie die Verdauung mit 40 Mikrolitern fetalem Rinderserum beenden. Filtern Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Rohr und übertragen Sie die gefilterte Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr.Füllen Sie die Suspension mit Basalmedium auf ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern auf. Nach der Zentrifugation resuspendiert das aus 24 Tröpfchen gesammelte Pellet in 1 bis 2,5 Milliliter Lungenorganoid-Expansionsmedium, abhängig von der Zelldichte. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit dem Zellzähler unter einem Mikroskop und passen Sie dann die Zellkonzentration auf 1,3 mal 10 bis sechs pro Milliliter für 24-Well-Einsätze an.Entfernen Sie das Basalmedium aus der oberen und unteren Kammer, bevor Sie 500 Mikroliter Expansionsmedium in die untere Kammer geben. 100 Mikroliter Zellsuspension zuvor auf die apikale Kammer des 24-Well-Einsatzes auftragen und inkubieren. Ersetzen Sie nach zwei Tagen das Expansionsmedium durch proximales Differenzierungsmedium sowohl in der apikalen als auch in der unteren Kammer der Platte.Inkubieren Sie die Organoide für 14 Tage und erfrischen Sie das Medium alle drei Tage. Messen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand jeden Tag mit einem elektrischen Widerstandsmesssystem. Auf der repräsentativen Mikrofotografie sind die frisch isolierten Lungenzellen zu sehen, die in die Basalmembranmatrix Typ zwei mit reduziertem Wachstumsfaktor eingebettet sind.Die zystischen Organoide wurden im Laufe der Zeit gezeigt und gezüchtet. Hier werden die Lungenorganoide nach der vierten Passage demonstriert. Innerhalb von zwei Stunden nach der mechanischen Scherung bildeten die in den Basalmembranextrakt eingebetteten Organoidfragmente die zystischen Domänen.Die Mikrofotografie des gleichen Feldes am fünften Tag bestätigte das Organoidwachstum im Laufe der Zeit. Die expandierenden Organoide beherbergten alle vier wichtigsten Epithelzelltypen der Atemwege, einschließlich ACCTUB-positiver oder FOXJ1-positiver Flimmerzelle, P63-positiver Basalzelle, CC10-positiver Clubzelle und MUC5AC-positiver Kelchzelle in einem vorzeitigen Zustand. Die im Expansions- und Proximaldifferenzierungsmedium inkubierten Organoide entwickelten im Laufe der Zeit eine ausgeprägte Morphologie.Nach zwei Wochen Differenzierung im proximalen Differenzierungsmedium waren in jedem Organoid bewegliche Zilien erkennbar. Es wurde beobachtet, dass die synchron schlagende Celia die Zelltrümmer in das Organoidlumen trieb und sie unidirektional wirbelte, um die eingeatmeten Partikel zu entfernen. Weiterhin zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse, dass die differenzierten Organoide vier Atemwegsepithelzelltypen in proximalem Differenzierungs- und Expansionsmedium beherbergten.Nach zweiwöchiger Differenzierung entwickelten 2D-Atemwegsorganoide eine intakte Epithelbarriere. Ein Dextran-Blockade-Assay wurde durchgeführt, um die Integrität der Epithelbarriere zu beurteilen, die in 2D-Atemwegsorganoiden gebildet wird. Die 2D-Organoide enthielten reichlich bewimperte Zellen.Das langfristig erweiterbare Lungenorganoid und das differenzierte Atemwegsorganoid bieten ein physiologisch aktives und universelles Modellsystem für die Untersuchung der Atemwegsbiologie und -pathologie, einschließlich COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Isolation und Kultur der menschlichen Reife Adipozyten mit Membran Reife Adipozyten Aggregatkulturen (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-Kultivierung von Organoiden aus dem intestinalen Zottenepithel, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...