Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Ringraziamo il Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, per l'assistenza nell'imaging confocale e nella citometria a flusso. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dai finanziamenti del Fondo per la salute e la ricerca medica (HMRF, 17161272 e 19180392) dell'Ufficio per la salute e la salute; Fondo generale di ricerca (GRF, 17105420) del Consiglio per le sovvenzioni alla ricerca; e Health@InnoHK Commissione per l'innovazione e la tecnologia, il governo della Regione amministrativa speciale di Hong Kong.

Tutti i esperimenti che utilizzano tessuti umani qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti prima della raccolta dei tessuti.
1. Derivazione dell'organoide polmonare umano
<ol><li>Preparazione di materiali sperimentali<ol>
<li>Preparare il mezzo basale integrando il mezzo DMEM / F12 avanzato con 2 mM di gl...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

Le vie aeree umane sono rivestite con l'epitelio delle vie aeree, noto anche come epitelio ciliato pseudostratificato. I principali tipi di cellule dell'epitelio delle vie aeree superiori sono le cellule ciliate che consentono il movimento coordinato delle loro ciglia apicali per espellere il muco e le particelle inalate dalle vie aeree, le cellule calici che producono e secernono muco e le cellule basali che rivestono la membrana basale e sono implicate nella rigenerazione. Nelle piccole vie aeree come i bronchioli, l'e...

Gli organoidi sono diventati uno strumento robusto e universale per la modellazione in vitro dello sviluppo degli organi e lo studio della biologia e delle malattie. Quando coltivate in un terreno di coltura definito dal fattore di crescita, le cellule staminali adulte (ASC) da una varietà di organi possono essere espanse in 3 dimensioni (3D) e auto-assemblate in cluster cellulari simili a organi composti da più tipi di cellule, denominati organoidi. Il laboratorio di Clevers ha riportato la derivazione del primo organoide derivato dall'ASC, organoide intestinale umano, nel 2009 1,2. Successivamente, gli organoidi derivati dall'ASC sono stati stabiliti per una varietà di organi e tessuti umani, tra cui prostata 3,4, fegato 5,6, stomaco 7,8,9, pancreas10, ghiandola mammaria11 e polmone 12,13 . Questi organoidi derivati dall'ASC hanno mantenuto le proprietà cellulari, strutturali e funzionali critiche dell'organo nativo e hanno mantenuto la stabilità genetica e fenotipica nella coltura di espansione a lungo termine14,15.
Gli organoidi possono anche essere derivati da cellule staminali pluripotenti (PSC), comprese le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS)16. Mentre gli organoidi derivati dal PSC sfruttano i meccanismi di sviluppo degli organi per la loro istituzione, gli ASC possono essere costretti a formare organoidi ricostruendo condizioni che imitano la nicchia delle cellule staminali durante l'auto-rinnovamento fisiologico dei tessuti o la riparazione dei tessuti. Gli organoidi derivati da PSC sono modelli favorevoli per esplorare lo sviluppo e l'organogenesi, sebbene incapaci di raggiungere il livello di maturazione comparabile degli organoidi derivati da ASC. Lo stato di maturazione simile a quello fetale degli organoidi derivati dal PSC e la complessità per stabilire questi organoidi impediscono sostanzialmente le loro ampie applicazioni per lo studio della biologia e della patologia nei tessuti maturi.
Il tratto respiratorio umano, dal naso al bronchiolo terminale, è rivestito con l'epitelio delle vie aeree, chiamato anche epitelio ciliato pseudostratificato, che consiste di quattro tipi di cellule principali, cioè cellule ciliate, cellule calici, cellule basali e cellule club. Abbiamo stabilito l'organoide polmonare umano derivato dall'ASC da tessuti polmonari umani in collaborazione con il laboratorio 12,13 di Clevers. Questi organoidi polmonari vengono espansi consecutivamente nel mezzo di espansione per oltre un anno; la durata precisa varia tra diverse linee organoidi ottenute da diversi donatori. Tuttavia, rispetto all'epitelio nativo delle vie aeree, questi organoidi polmonari espandibili a lungo termine non sono abbastanza maturi poiché le cellule ciliate, la principale popolazione cellulare nelle vie aeree umane, sono sottorappresentate in questi organoidi polmonari. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di differenziazione prossimale e generato organoidi delle vie aeree 3D e 2D che morfologicamente e funzionalmente fenocopio l'epitelio delle vie aeree a un livello quasi fisiologico.
Qui forniamo un protocollo video per derivare organoidi polmonari umani dai tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

La mancanza di un robusto modello in vitro dell'epitelio respiratorio umano ostacola la comprensione della biologia e della patologia dell'apparato respiratorio. Descriviamo un protocollo definito per derivare organoidi polmonari umani da cellule staminali adulte nel tessuto polmonare e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree. Gli organoidi polmonari vengono poi espansi consecutivamente per oltre 1 anno con elevata stabilità, mentre gli organoidi differenziati delle vie aeree vengono utilizzati per simulare morfologicamente e funzionalmente l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico. Pertanto, stabiliamo un robusto modello organoide dell'epitelio delle vie aeree umane. L'espansione a lungo termine degli organoidi polmonari e degli organoidi differenziati delle vie aeree genera una fonte stabile e rinnovabile, consentendo agli scienziati di ricostruire ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree umane nei piatti di coltura. Il sistema organoide polmonare umano fornisce un modello in vitro unico e fisiologicamente attivo per varie applicazioni, tra cui lo studio dell'interazione virus-ospite, test antidroga e modellazione della malattia.

Questo protocollo consente la derivazione di organoidi polmonari umani con un alto tasso di successo. Il tessuto polmonare umano fresco viene tritato in piccoli pezzi e quindi decomposto con collagenasi. Le singole cellule risultanti sono incorporate nella matrice basale e incubate nel mezzo di espansione organoide polmonare integrato con un cocktail di fattori di nicchia per la crescita delle cellule staminali epiteliali (fase 1.1.2). La Figura 1 mostra la microfotografia di cellule polmona...

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Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

Il protocollo presenta un metodo per derivare organoidi polmonari umani da tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D che fenocopio fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane.

Stabilire organoidi polmonari umani e differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Stiamo introducendo un metodo per stabilire la coltura organoide dell'epitelio delle vie aeree umane in piastre di coltura. Deriviamo organoidi polmonari umani direttamente dai tessuti polmonari primari ad alta efficienza. Gli organoidi polmonari umani derivati sono stabilmente espansi per oltre un anno e un protocollo di differenziazione prossimale consente la generazione di organoidi maturi delle vie aeree in grado di simulare fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico.Pertanto, il sistema di coltura consente agli scienziati di ricostruire ed espandere l'epitelio delle vie aeree umane nelle piastre di coltura. A dimostrare la procedura saranno Man Chun Chiu e Yifei Yu, dottorandi nel nostro laboratorio Per iniziare l'isolamento cellulare dai tessuti polmonari umani per la coltura di organoidi 3D, tritare i tessuti polmonari in piccoli pezzi di un millimetro con un bisturi sterile e lavare i pezzi di tessuto con 10 millilitri di mezzo basale freddo. Centrifugare i tessuti a 400 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in otto millilitri di mezzo basale integrato con collagenasi ad una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro.Quindi, digerire i pezzi di tessuto agitando il tubo a 120 RPM per 30-40 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la digestione, pipettare su e giù 20 volte usando una pipetta sierologica da 10 millilitri per tagliare i pezzi di tessuto digerito. Quindi, filtrare la sospensione con un filtro da 100 micron in un tubo da 50 millilitri.Recuperare e trasferire i pezzi di tessuto dal filtro a un tubo di centrifuga da 15 millilitri con il mezzo basale. Per terminare la digestione, aggiungere il siero bovino fetale al flusso fino a una concentrazione finale del 2%, quindi centrifugare il tubo e risospescere il pellet cellulare in 10 millilitri del mezzo basale come descritto prima. Dopo la centrifugazione, risospesere il pellet in 80-160 microlitri di mezzo a matrice fredda del basamento e posizionare i tubi sul ghiaccio.Quindi, erogare 40 microlitri della sospensione a ciascun pozzetto di una piastra di coltura di sospensione a 24 pozzetti preriscaldata. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Lasciare che la matrice del seminterrato si solidifichi e formi una goccia.Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di organoidi polmonari umani mezzo di espansione integrato con cinque nanomolari di heregulin-beta 1 a ciascun pozzetto e incubare la piastra in un incubatore di colture cellulari. Dopo tre giorni, rimuovere il vecchio mezzo mantenendo intatta la goccia e aggiungere con cura il mezzo fresco. Dopo 10-14 giorni di passaggio, osservare gli organoidi al microscopio e assicurarsi che gli organoidi non siano incorporati con una densità cellulare molto elevata.Per passare gli organoidi polmonari con la tosatura, rompere le goccioline tubando su e giù con una punta di un millilitro. Quindi, trasferire gli organoidi insieme al mezzo in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e regolare il volume a 10 millilitri con un mezzo basale freddo. Centrifugare il tubo a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante e lavare gli organoidi con 10 millilitri di mezzo basale freddo.Quindi, risospese gli organoidi in due millilitri di mezzo basale freddo e tagliarli in piccoli pezzi con una pipetta Pasteur. Quindi, aggiungere il mezzo basale a un volume totale di 10 millilitri e centrifugare prima di risospescere i frammenti organoidi con una matrice basale fredda sufficiente per consentire un'espansione da 1:3 a 1:5 e posizionare i tubi sul ghiaccio. Erogare 40 microlitri di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti per incubare a 37 gradi Celsius per consentire alla matrice basale di solidificarsi per 10-15 minuti.Successivamente, aggiungere 500 microlitri di terreno di espansione organoide polmonare a ciascun pozzetto e incubare in un incubatore di colture cellulari. Rinfrescare il mezzo ogni tre giorni e passare gli organoidi ogni due settimane. Per passare gli organoidi polmonari con tripsinizzazione, risospese gli organoidi polmonari raccolti in un millilitro di enzima di dissociazione.Incubare l'organoide in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo basale al tubo e tagliare meccanicamente gli organoidi tubando su e giù. Controllare la dimensione dei pezzi organoidi al microscopio con ingrandimento 100X prima di terminare la digestione con 40 microlitri di siero bovino fetale.Portare il volume a 10 millilitri con mezzo basale e centrifuga prima di risospendere i pezzi organoidi in una matrice fredda del basamento con un volume sufficiente al passaggio con un rapporto da 1:5 a 1:10. Successivamente, erogare 40 microlitri di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e coltivare la piastra come dimostrato in precedenza. Per generare organoidi 3D delle vie aeree, incubare gli organoidi polmonari nel mezzo di espansione per sette-10 giorni dopo il passaggio tramite taglio meccanico.Quindi, sostituire il mezzo di espansione con il mezzo di differenziazione prossimale e incubare gli organoidi in un incubatore di colture cellulari. Dopo 14 giorni, scartare il mezzo in ciascun pozzetto e aggiungere un tampone di lisato cellulare per raccogliere l'organoide differenziato delle vie aeree per l'estrazione dell'RNA e il rilevamento dell'espressione genica cellulare mediante il test RT-qPCR. Pre-incubare gli inserti nell'incubatore di colture cellulari con 250 e 500 microlitri del mezzo basale nella camera superiore e inferiore di una piastra a 24 pozzetti, rispettivamente.Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo basale al tubo e pipettare su e giù per tagliare gli organoidi in singole cellule. Osservare le cellule al microscopio prima di terminare la digestione con 40 microlitri di siero bovino fetale. Filtrare le celle attraverso un filtro da 40 micron in un tubo da 50 millilitri e trasferire la sospensione cellulare filtrata in un tubo da 15 millilitri.Riempire la sospensione con mezzo basale per un volume totale di 10 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospesare il pellet raccolto da 24 goccioline in 1 a 2,5 millilitri di mezzo di espansione organoide polmonare, a seconda della densità cellulare. Contare il numero di cellule con il contatore cellulare al microscopio, quindi regolare la concentrazione cellulare a 1,3 volte 10 a sei per millilitro per inserti a 24 pozzetti.Rimuovere il mezzo basale dalle camere superiore e inferiore prima di aggiungere 500 microlitri di terreno di espansione nella camera inferiore. Semina 100 microlitri di sospensione cellulare preparati in precedenza sulla camera apicale dell'inserto a 24 pozzetti e incubano. Dopo due giorni, sostituire il mezzo di espansione con il mezzo di differenziazione prossimale sia nella camera apicale che in quella inferiore della piastra.Incubare gli organoidi per 14 giorni e rinfrescare il mezzo ogni tre giorni. Misurare la resistenza elettrica transepiteliale ogni giorno utilizzando un sistema di misurazione della resistenza elettrica. Nella microfotografia rappresentativa, le cellule polmonari appena isolate possono essere viste incorporate nella matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto di tipo due.Gli organoidi cistici sono apparsi e cresciuti nel tempo. Gli organoidi polmonari dopo il quarto passaggio sono dimostrati qui. Entro due ore dalla cesoiatura meccanica, i frammenti organoidi incorporati nell'estratto della membrana basale formavano i domini cistici.La microfotografia dello stesso campo il quinto giorno ha confermato la crescita organoide nel tempo. Gli organoidi in espansione ospitavano tutti e quattro i principali tipi di cellule epiteliali delle vie aeree, tra cui la cellula ciliata ACCTUB-positiva o FOXJ1-positiva, la cellula basale P63-positiva, la cellula club CC10-positiva e la cellula calice MUC5AC-positiva in uno stato prematuro. Gli organoidi incubati nel mezzo di espansione e differenziazione prossimale hanno sviluppato nel tempo una morfologia distinta.Dopo due settimane di differenziazione nel mezzo di differenziazione prossimale, le ciglia mobili erano distinguibili in ogni organoide. È stato osservato che la celia che batte in modo sincrono ha guidato i detriti cellulari all'interno del lume organoide e li ha fatti roteare in modo unidirezionale per rimuovere le particelle inalate. Inoltre, l'analisi della citometria a flusso ha dimostrato che gli organoidi differenziati ospitavano quattro tipi di cellule epiteliali delle vie aeree nel mezzo di differenziazione ed espansione prossimale.Dopo due settimane di differenziazione, gli organoidi delle vie aeree 2D hanno sviluppato una barriera epiteliale intatta. È stato eseguito un test di blocco del destro per valutare l'integrità della barriera epiteliale formata negli organoidi delle vie aeree 2D. Gli organoidi 2D contenevano abbondanti cellule ciliate.L'organoide polmonare espandibile a lungo termine e l'organoide differenziato delle vie aeree forniscono un sistema modello fisiologicamente attivo e universale per lo studio della biologia e della patologia respiratoria, incluso COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biology

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Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

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