Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

我々は、共焦点イメージング及びフローサイトメトリーにおける支援に対し、香港大学李開清医学部パノラマ科学・電子顕微鏡ユニットに感謝する。この研究は、食品衛生局の保健医療研究基金(HMRF、17161272、19180392)からの資金提供によって部分的に支援されました。研究助成審議会の一般研究費(GRF、17105420)Health@InnoHK、イノベーション・テクノロジー委員会、香港特別行政区政府。

本明細書に記載のヒト組織を用いた全ての実験は、香港大学/病院局香港西クラスター(UW13-364およびUW21-695)の治験審査委員会によって承認された。インフォームドコンセントは、組織採取前に患者から得られた。
1. ヒト肺オルガノイドの導出
<ol><li>実験材料の調製<ol>
<li>高度DMEM/F12培地に2 mMグルタミン、10 mM HEPES、100 U/mLのペニシリン、100 μg/mLのストレプト?...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

人間の気道は、偽層状繊毛上皮としても知られる気道上皮で並んでいます。上気道上皮の主な細胞型は、頂端繊毛の協調運動が気道から粘液および吸入粒子を排出することを可能にする繊毛細胞、粘液を産生および分泌する杯細胞、および基底膜に並び再生に関与する基底細胞である。細気管支のような小さな気道では、直方体気道上皮は分泌クラブ細胞を含み、上気道領域よりも繊毛細胞?...

オルガノイドは、臓器発生のインビトロモデリングと生物学と疾患の研究のための堅牢で普遍的なツールとなっています。成長因子で定義された培養培地で培養すると、様々な器官からの成体幹細胞(ASC)を3次元(3D)で増殖させ、オルガノイドと呼ばれる複数の細胞型からなる器官様細胞クラスターに自己組織化することができる。Cleversの研究室は、2009年に最初のASC由来オルガノイドであるヒト腸管オルガノイドの誘導体を報告した1,2。その後、ASC由来オルガノイドは、前立腺3、4、肝臓5、6、胃7、8、9、膵臓10、乳腺11、および肺12,13を含む様々なヒト器官および組織について確立されている。.これらのASC由来オルガノイドは、天然器官の重要な細胞的、構造的、および機能的特性を保持し、長期拡大培養において遺伝的および表現型の安定性を維持した14、15。
オルガノイドはまた、胚性幹(ES)細胞および人工多能性幹(iPS)細胞16を含む多能性幹細胞(PSC)に由来することもできる。PSC由来のオルガノイドは、その確立のために臓器発達のメカニズムを利用するが、ASCは、生理学的組織の自己複製または組織修復中に幹細胞ニッチを模倣する条件を再構築することによって、オルガノイドを形成するように強制され得る。PSC由来オルガノイドは、ASC由来オルガノイドの同等の成熟レベルに達することはできないものの、発生および器官形成を探索するのに好ましいモデルである。PSC由来オルガノイドの胎児様成熟状態、およびこれらのオルガノイドを確立するための複雑さは、成熟組織における生物学および病理学を研究するためのそれらの広範な適用を実質的に妨げる。
ヒト気道は、鼻から末端気管支まで、4つの主要な細胞タイプ、すなわち繊毛細胞、杯細胞、基底細胞、およびクラブ細胞からなる偽層状繊毛上皮とも呼ばれる気道上皮に並んでいる。我々は、Cleversの研究室12,13と共同で、ヒト肺組織からASC由来のヒト肺オルガノイドを樹立した。これらの肺オルガノイドは、1年以上にわたって拡張培地中で連続して拡張される。正確な持続時間は、異なるドナーから得られた異なるオルガノイド系統間で異なる。しかし、天然の気道上皮と比較して、これらの長期拡張可能な肺オルガノイドは、ヒト気道の主要な細胞集団である繊毛細胞がこれらの肺オルガノイドにおいて過小に表現されているため、十分に成熟していない。そこで、近位分化プロトコールを開発し、気道上皮を生理学的に近いレベルまで形態学的および機能的に表現写用する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成しました。
ここでは、一次肺組織からヒト肺オルガノイドを導出し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して3Dおよび2D気道オルガノイドを生成するためのビデオプロトコルを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

ヒト呼吸器上皮の堅牢な インビトロ モデルの欠如は、呼吸器系の生物学および病理学の理解を妨げる。我々は、肺組織中の成体幹細胞からヒト肺オルガノイドを誘導し、近位分化を誘導して成熟気道オルガノイドを生成するための定義されたプロトコールを記述する。その後、肺オルガノイドは高い安定性で1年以上連続して拡張され、分化した気道オルガノイドは、ヒト気道上皮をほぼ生理学的レベルまで形態学的および機能的にシミュレートするために使用される。これにより、ヒト気道上皮の堅牢なオルガノイドモデルを確立した。肺オルガノイドと分化した気道オルガノイドの長期的な拡大は、安定した再生可能な供給源を生成し、科学者が培養皿中のヒト気道上皮細胞を再構築および拡張することを可能にする。ヒト肺オルガノイド系は、ウイルス-宿主相互作用の研究、薬物検査、および疾患モデリングを含む、様々な用途のためのユニークで生理学的に活性な in vitro モデルを提供する。

このプロトコルは、高い成功率を有するヒト肺オルガノイドの誘導を可能にする。新鮮なヒト肺組織は細かく細かくなり、次いでコラゲナーゼで分解される。得られた単一細胞を地下マトリックスに包埋し、上皮幹細胞の伸長のためのニッチ因子のカクテルを添加した肺オルガノイド膨張培地中でインキュベートする(ステップ1.1.2)。 図1 は、還元増殖因子基底膜マトリ...

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Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

このプロトコルは、初代肺組織からヒト肺オルガノイドを誘導し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して、ヒト気道上皮を忠実に表現鏡検査する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成する方法を提示する。

ヒト肺オルガノイドの確立と近位分化による成熟気道オルガノイドの生成

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

ヒト気道上皮のオルガノイド培養を培養プレートに樹立する方法を導入している。ヒト肺オルガノイドは、一次肺組織から直接高効率で導出します。誘導されたヒト肺オルガノイドは1年以上にわたって安定に拡張され、近位分化プロトコルは、ヒト気道上皮をほぼ生理学的レベルまで忠実にシミュレートすることができる成熟気道オルガノイドの生成を可能にする。したがって、培養システムは、科学者が培養プレート中のヒト気道上皮を再構築および拡張することを可能にする。手順を実証する Man Chun ChiuとYifei Yu、私たちの研究室の博士課程の学生です 3Dオルガノイド培養のためにヒト肺組織からの細胞単離を開始するには、滅菌メスで肺組織を1ミリメートルの小片に細かく刻み、10ミリリットルの冷たい基礎培地で組織片を洗う。組織を400倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨ててから、コラゲナーゼを1ミリリットルあたり2ミリグラムの最終濃度で添加した8ミリリットルの基礎培地にペレットを再懸濁させた。次いで、チューブを摂氏37度で30〜40分間、120RPMで振盪することによって組織片を消化する。消化後、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いてピペットを上下に20回、消化した組織片を剪断した。次に、懸濁液を100ミクロンのストレーナーで50ミリリットルのチューブにろ過します。組織片をストレーナーから回収し、基礎培地を含む15ミリリットルの遠沈管に移す。消化を終了するために、ウシ胎児血清を最終濃度2%までフロースルーに加え、次いで、チューブを遠心分離し、前述のように細胞ペレットを10ミリリットルの基礎培地に再懸濁する。遠心分離後、ペレットを80〜160マイクロリットルの冷たい地下室マトリックス培地に再懸濁し、チューブを氷上に置く。次に、予め加温した24穴浮遊培養プレートの各ウェルに40マイクロリットルの懸濁液を分注する。プレートを摂氏37度で10〜15分間インキュベートする。地下室のマトリックスが固化し、液滴を形成するのを許します。インキュベーション後、5ナノモルのヘレグリンβ1を添加した500マイクロリットルのヒト肺オルガノイド増殖培地を各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。3日後、液滴をそのまま保ちながら古い培地を取り除き、新鮮な培地を慎重に加える。継代の10〜14日後、顕微鏡下でオルガノイドを観察し、オルガノイドが非常に高い細胞密度で埋め込まれていないことを確認する。剪断で肺オルガノイドを通過させるには、1ミリリットルの先端で上下にピペッティングして液滴を切断する。次に、オルガノイドを培地とともに15ミリリットルの遠沈管に移し、冷たい基礎培地で体積を10ミリリットルに調整する。チューブを300倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨て、オルガノイドを10ミリリットルの冷たい基礎培地で洗浄する。その後、オルガノイドを2ミリリットルの冷たい基礎培地に再懸濁し、パスツールピペットで小片に剪断する。次に、基礎培地を総容量10ミリリットルに加え、遠心分離機をかけてから、オルガノイド断片を1:3〜1:5の膨張を可能にするのに十分な冷たい地下室マトリックスで再懸濁し、チューブを氷の上に置きます。予め加温した24ウェルプレートの各ウェルに40マイクロリットルのオルガノイド懸濁液を分注し、摂氏37度でインキュベートして、地下室マトリックスを10〜15分間固化させる。その後、各ウェルに500マイクロリットルの肺オルガノイド膨張培地を加え、細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。3日ごとに培地をリフレッシュし、2週間ごとにオルガノイドを継代する。トリプシン処理で肺オルガノイドを通過させるために、採取した肺オルガノイドを1ミリリットルの解離酵素で再懸濁する。オルガノイドを摂氏37度の水浴中で3〜5分間孵化させる。次に、1ミリリットルの基礎培地をチューブに加え、上下にピペッティングしてオルガノイドを機械的に剪断する。40マイクロリットルのウシ胎児血清で消化を終了する前に、100倍の倍率で顕微鏡下でオルガノイド片のサイズを確認してください。1:5〜1:10の比率で通過するのに十分な体積を有する冷たい地下室マトリックスにオルガノイド片を再懸濁する前に、基礎培地および遠心分離機で体積を10ミリリットルにする。その後、24ウェルプレートの各ウェルに40マイクロリットルのオルガノイド懸濁液を分注し、前に実証したようにプレートを培養する。3D気道オルガノイドを生成するには、機械的剪断を介して継代後7〜10日間、肺オルガノイドを膨張培地中でインキュベートする。次いで、膨張培地を近位分化培地と交換し、細胞培養インキュベーター内でオルガノイドをインキュベートする。14日後、各ウェル内の培地を捨て、細胞破砕液緩衝液を加えて、RNA抽出およびRT-qPCRアッセイによる細胞遺伝子発現の検出のために分化気道オルガノイドを回収した。細胞培養インキュベーター内のインサートを、それぞれ24ウェルプレートの上部および下部チャンバー内の250および500マイクロリットルの基礎培地と共にプレインキュベートする。次に、1ミリリットルの基礎培地をチューブに加え、ピペットを上下にしてオルガノイドを単一細胞に剪断する。40マイクロリットルのウシ胎児血清で消化を終了する前に、顕微鏡下で細胞を観察してください。細胞を40ミクロンのストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに濾過し、濾過した細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移す。懸濁液を基礎培地で10ミリリットルの総容量まで補充する。遠心分離後、細胞密度に応じて、24滴から回収したペレットを1〜2.5ミリリットルの肺オルガノイド膨張培地に再懸濁する。顕微鏡下で細胞カウンターで細胞数をカウントし、細胞濃度を24ウェルインサートの場合、1ミリリットルあたり6倍に対して10倍から1.3倍に調整します。上部チャンバと下部チャンバから基礎培地を取り出してから、下部チャンバに500マイクロリットルの膨張培地を追加します。先に調製した細胞懸濁液100マイクロリットルの種子を24ウェルインサートの頂端チャンバー上にインキュベートした。2日後、プレートの頂端および底部チャンバの両方で拡張培地を近位分化培地と交換する。オルガノイドを14日間インキュベートし、3日ごとに培地をリフレッシュする。電気抵抗測定システムを用いて毎日上皮経管電気抵抗を測定する。代表的な顕微鏡写真では、新たに単離された肺細胞が、還元された成長因子基底膜マトリックス2型に埋め込まれているのが分かる。嚢胞性オルガノイドが出現し、時間の経過とともに成長した。第4継代後の肺オルガノイドがここで実証される。機械的剪断から2時間以内に、基底膜抽出物に埋め込まれたオルガノイド断片は嚢胞性ドメインを形成した。5日目の同じフィールドの顕微鏡写真は、経時的なオルガノイド増殖を確認した。拡張オルガノイドは、ACCTUB陽性またはFOXJ1陽性繊毛細胞、P63陽性基底細胞、CC10陽性クラブ細胞、および早期状態のMUC5AC陽性杯細胞を含む4つの主要な気道上皮細胞タイプをすべて保有していた。拡張および近位分化培地中でインキュベートされたオルガノイドは、時間の経過とともに明確な形態を発達させた。近位分化培地での分化の2週間後、運動性繊毛はすべてのオルガノイドにおいて識別可能であった。同期的に鼓動するセリアがオルガノイド内腔内の細胞破片を駆動し、それらを一方向に渦巻いて吸入粒子を除去することが観察された。さらに、フローサイトメトリー分析は、分化したオルガノイドが近位分化および拡張培地中に4つの気道上皮細胞型を収容することを実証した。分化の2週間後、2D気道オルガノイドは無傷の上皮障壁を発達させた。2D気道オルガノイドにおいて形成された上皮障壁の完全性を評価するために、デキストラン遮断アッセイを実施した。2Dオルガノイドは豊富な繊毛細胞を含んでいた。長期拡張可能な肺オルガノイドおよび分化気道オルガノイドは、COVID-19を含む呼吸器生物学および病理学を研究するための生理学的に活性で普遍的なモデルシステムを提供する。

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を用いたヒト成熟性の単離と培養

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...