Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

우리는 공초점 이미징 및 유세포 측정에 도움을 주신 PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Hong Kong에 감사드립니다. 이 작업은 식품 보건국의 건강 및 의료 연구 기금 (HMRF, 17161272 및 19180392)의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 연구 보조금위원회의 일반 연구 기금 (GRF, 17105420); Health@InnoHK, 혁신 기술위원회, 홍콩 특별 행정 구역 정부.

본원에 기술된 인간 조직을 이용한 모든 실험은 홍콩 대학/병원 당국 홍콩 서부 클러스터(UW13-364 및 UW21-695)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다. 조직 수집 전에 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다.
1. 인간 폐 오가노이드의 유도
<ol><li>실험자료의 제조<ol>
<li>고급 DMEM/F12 배지에 2mM 글루타민, 10mM HEPES, 100U/mL의 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신을 보?...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

인간 기도는 의사 층화 된 섬모 상피라고도 알려진 기도 상피와 줄 지어 있습니다. 상부 기도 상피의 주요 세포 유형은 기도에서 점액과 흡입된 입자를 배출하기 위해 정수리 섬모의 조율된 이동을 가능하게 하는 섬모 세포, 점액을 생산하고 분비하는 잔 세포, 기저막을 늘어서서 재생에 연루된 기저 세포이다. 세기관지와 같은 작은 기도에서, 입방체 기도 상피는 분비 클럽 세포를 포함하고 상부 ...

오가노이드는 장기 발달의 시험관 내 모델링과 생물학 및 질병 연구를위한 강력하고 보편적 인 도구가되었습니다. 성장 인자 정의 배양 배지에서 배양하는 경우, 다양한 장기로부터의 성체 줄기 세포 (ASC)는 3차원 (3D)으로 확장될 수 있고 오가노이드라고 불리는 다중 세포 유형으로 구성된 장기 유사 세포 클러스터로 자기조립될 수 있다. 클레버즈의 실험실은 2009 년 1,2 년에 최초의 ASC 유래 오가노이드 인 인간 장내 오가노이드의 유도를보고했다. 그 후, ASC 유래 오가노이드는 전립선 3,4, 간 5,6, 위 7,8,9, 췌장 10, 유선 11 및 폐 12,13을 포함한 다양한 인간 장기 및 조직에 대해 확립되었다. . 이들 ASC 유래 오가노이드는 천연 장기의 중요한 세포, 구조적, 기능적 특성을 유지하고, 장기 확장 배양물에서 유전적 및 표현형 안정성을 유지하였다(14,15).
오가노이드는 또한 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 (16)를 포함하는 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래될 수 있다. PSC 유래 오가노이드는 그들의 설립을 위해 장기 발달의 메커니즘을 이용하는 반면, ASC는 생리적 인 조직 자체 재생 또는 조직 복구 중에 줄기 세포 틈새를 모방하는 조건을 재건함으로써 오가노이드를 형성하도록 강요 될 수 있습니다. PSC 유래 오가노이드는 ASC 유래 오가노이드의 비교 가능한 성숙 수준에 도달 할 수는 없지만 발달 및 유기 발생을 탐구하는 데 유리한 모델입니다. PSC 유래 오가노이드의 태아와 유사한 성숙 상태 및 이러한 오가노이드를 확립하기위한 복잡성은 성숙한 조직에서 생물학 및 병리학을 연구하기위한 광범위한 적용을 실질적으로 방해합니다.
코에서 말단 세기관지까지 인간의 호흡기는 기도 상피(pseudostratified ciliated epithelium)라고도 불리우며, 이는 네 가지 주요 세포 유형, 즉 섬모 세포, 잔 세포, 기저 세포 및 클럽 세포로 구성됩니다. 우리는 Clevers의 실험실12,13과 협력하여 인간 폐 조직에서 ASC 유래 인간 폐 오가노이드를 설립했습니다. 이들 폐 오가노이드는 일 년 이상 동안 확장 배지에서 연속적으로 확장되고; 정확한 지속 기간은 다른 기증자로부터 얻은 다른 오가노이드 라인에 따라 다릅니다. 그러나, 천연 기도 상피와 비교하여, 이러한 장기 팽창성 폐 오가노이드는 인간 기도의 주요 세포 집단인 섬모 세포가 이들 폐 오가노이드에서 과소 대표되기 때문에 충분히 성숙하지 않다. 따라서, 우리는 근위 분화 프로토콜을 개발하고기도 상피를 거의 생리적 수준으로 형태학적으로 그리고 기능적으로 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성했습니다.
여기서 우리는 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 비디오 프로토콜을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

인간 호흡 상피의 강력한 시험관 내 모델의 부족은 호흡기의 생물학 및 병리학에 대한 이해를 방해합니다. 우리는 폐 조직의 성체 줄기 세포로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고 성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 정의된 프로토콜을 기술한다. 폐 오가노이드는 높은 안정성으로 1 년 이상 연속적으로 확장되는 반면, 분화 된기도 오가노이드는 형태 학적으로나 기능적으로 인간의 기도 상피를 거의 생리적 수준으로 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 따라서, 우리는 인간기도 상피의 강력한 오가노이드 모델을 확립합니다. 폐 오가노이드와 분화 된기도 오가노이드의 장기간 확장은 안정적이고 재생 가능한 공급원을 생성하여 과학자들이 배양 접시에서 인간기도 상피 세포를 재구성하고 확장 할 수있게합니다. 인간 폐 오가노이드 시스템은 바이러스-숙주 상호작용 연구, 약물 테스트 및 질병 모델링을 포함한 다양한 응용을 위한 독특하고 생리활성 시험관내 모델을 제공한다.

이 프로토콜은 높은 성공률을 가진 인간 폐 오가노이드의 유도를 가능하게 한다. 신선한 인간 폐 조직은 작은 조각으로 다진 다음 콜라게나제로 분해됩니다. 생성된 단일 세포는 기저 매트릭스에 포매되고 상피 줄기 세포의 증식을 위한 틈새 인자의 칵테일로 보충된 폐 오가노이드 확장 배지에서 배양된다(단계 1.1.2). 도 1 은 환원 성장인자 기저막 매트릭스 타입 2에 포매된 ...

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Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.

성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

우리는 배양 접시에서 인간 기도 상피의 오가노이드 배양을 확립하는 방법을 소개하고 있습니다. 우리는 높은 효율로 원발성 폐 조직에서 직접 인간의 폐 오가노이드를 파생시킵니다. 유래된 인간 폐 오가노이드는 일 년 이상 안정적으로 확장되며, 근위 분화 프로토콜은 인간 기도 상피를 거의 생리학적 수준으로 충실하게 시뮬레이션할 수 있는 성숙한 기도 오가노이드의 생성을 허용한다.따라서 배양 시스템은 과학자들이 배양 접시에서 인간기도 상피를 재구성하고 확장 할 수있게합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Man Chun Chiu와 Yifei Yu, PhD 학생들이 3D 오가노이드 배양을위한 인간 폐 조직으로부터 세포 분리를 시작하려면 폐 조직을 멸균 메스로 1 밀리미터 작은 조각으로 다듬고 차가운 기저 배지 10 밀리리터로 조직 조각을 씻으십시오. 조직을 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 G에서 원심분리하고, 콜라게나제가 보충된 8밀리리터의 기초 배지에 펠렛을 밀리리터당 두 밀리그램의 최종 농도로 재현탁시키기 전에 상층액을 버린다.이어서, 섭씨 37도에서 30 내지 40분 동안 120 RPM에서 튜브를 흔들어 조직 조각을 소화시킨다. 소화 후, 10 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 20 번 위아래로 피펫을 사용하여 소화 된 조직 조각을 전단합니다. 그런 다음 현탁액을 100미크론 스트레이너로 50밀리리터 튜브로 여과합니다.조직 조각을 회수하여 스트레이너로부터 기본 배지가 있는 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화를 종결시키기 위해, 유동관에 우태아 혈청을 2%의 최종 농도로 첨가한 다음, 튜브를 원심분리하고, 앞서 기술한 바와 같이 세포 펠릿을 10 밀리리터의 기초 배지에 재현탁시킨다. 원심분리 후, 펠렛을 80 내지 160 마이크로리터의 차가운 지하실 매트릭스 배지에 재현탁시키고 튜브를 얼음 위에 놓는다.다음에, 40 마이크로리터의 현탁액을 미리 가온된 24-웰 현탁액 배양 플레이트의 각 웰에 분배한다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 응고되어 물방울을 형성하도록하십시오.배양 후, 500 마이크로리터의 헤레굴린-베타 1의 나노몰로 보충된 인간 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 인큐베이션한다. 사흘 후, 물방울을 그대로 유지하면서 오래된 배지를 제거하고 조심스럽게 신선한 배지를 추가하십시오. 통과 후 10 ~ 14 일 후에 현미경으로 오가노이드를 관찰하고 오가노이드가 매우 높은 세포 밀도로 매립되지 않았는지 확인하십시오.전단으로 폐 오가노이드를 통과하려면 한 밀리리터 팁으로 위아래로 피펫팅하여 물방울을 부러 뜨립니다. 그런 다음 배지와 함께 오가노이드를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 차가운 기저 배지로 부피를 10 밀리리터로 조정하십시오. 튜브를 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리하고, 상층액을 버리고, 10밀리리터의 차가운 기저 배지로 오가노이드를 세척한다.그런 다음 오가노이드를 차가운 기저 배지 두 밀리리터에 재현탁하고 파스퇴르 피펫으로 작은 조각으로 전단하십시오. 다음으로, 1:3 내지 1:5 팽창을 가능하게 하기에 충분한 차가운 지하실 매트릭스로 오가노이드 단편을 재현탁하기 전에 10 밀리리터의 총 부피에 기초 배지를 첨가하고 튜브를 얼음 위에 놓는다. 미리 가온된 24웰 플레이트의 각 웰에 40마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 분배하여 섭씨 37도에서 인큐베이션하여 지하 매트릭스가 10 내지 15분 동안 응고되도록 한다.나중에, 500 마이크로리터의 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 사흘마다 배지를 새로 고치고 두 주마다 오가노이드를 통과시킵니다. 트립신화로 폐 오가노이드를 통과시키려면 수확 된 폐 오가노이드를 해리 효소 한 밀리리터에 재현탁하십시오.오르가노이드를 섭씨 37도 수조에서 3 ~ 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브에 한 밀리리터의 기본 배지를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 전단합니다. 40 마이크로 리터의 태아 소 혈청으로 소화를 종료하기 전에 100X 배율로 현미경으로 오가노이드 조각의 크기를 확인하십시오.1:5 내지 1:10의 비율로 통과하기에 충분한 부피로 차가운 지하실 매트릭스에 오가노이드 조각을 재현탁하기 전에 기저 배지와 원심 분리기로 부피를 10 밀리리터까지 구성하십시오. 나중에, 40 마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 24-웰 플레이트의 각 웰에 분배하고, 이전에 입증된 바와 같이 플레이트를 배양한다. 3D 기도 오가노이드를 생성하려면, 기계적 전단을 통해 통과 후 7 내지 10일 동안 팽창 배지에서 폐 오가노이드를 인큐베이션한다.이어서, 확장 배지를 근위 분화 배지로 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 오가노이드를 인큐베이션한다. 14일 후, 각 웰의 배지를 버리고 세포 용해물 완충액을 첨가하여 RNA 추출 및 RT-qPCR 분석법에 의한 세포 유전자 발현의 검출을 위해 분화된 기도 오가노이드를 수확한다. 예비-세포 배양 인큐베이터 내의 삽입물을 각각 24-웰 플레이트의 상부 및 하부 챔버 내의 250 및 500 마이크로리터의 기저 배지와 함께 인큐베이션한다.그런 다음 한 밀리리터의 기본 배지를 튜브에 넣고 피펫을 위아래로 피펫하여 오가노이드를 단일 세포로 전단하십시오. 40 마이크로 리터의 태아 소 혈청으로 소화를 종료하기 전에 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포를 40미크론 스트레이너를 통해 50밀리리터 튜브로 여과하고 여과된 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.현탁액을 기본 매체로 보충하여 총 부피가 10 밀리리터입니다. 원심분리 후, 세포 밀도에 따라 1 내지 2.5 밀리리터의 폐 오가노이드 확장 배지에 24개의 액적으로부터 수집된 펠렛을 재현탁시킨다. 현미경으로 세포 계수기를 가진 세포의 수를 세고, 세포 농도를 24-웰 삽입물에 대해 밀리리터 당 10배에서 6배로 1.3배로 조정하십시오.바닥 챔버에 500 마이크로리터의 팽창 배지를 첨가하기 전에 상부 및 하부 챔버로부터 기초 매질을 제거한다. 앞서 준비한 세포 현탁액 100 마이크로리터를 24-웰 인서트의 정점 챔버 상에 시드하고 인큐베이션한다. 이틀 후, 팽창 배지를 플레이트의 정점 및 바닥 챔버 모두에서 근위 분화 배지로 교체한다.오가노이드를 14 일 동안 배양하고 사흘마다 배지를 새로 고칩니다. 전기 저항 측정 시스템을 사용하여 매일 상피 전기 저항을 측정하십시오. 대표적인 현미경 사진에서, 갓 분리된 폐 세포는 환원된 성장 인자 기저막 매트릭스 유형 두 형에 매립되어 있음을 알 수 있다.낭포성 오가노이드가 나타나고 시간이 지남에 따라 성장했습니다. 네 번째 통로 이후의 폐 오가노이드가 여기에서 입증됩니다. 기계적 전단 후 두 시간 이내에, 기저막 추출물에 포매된 오가노이드 단편은 낭성 도메인을 형성하였다.다섯 번째 날에 같은 필드의 현미경 사진은 시간에 따른 오가노이드 성장을 확인했다. 확장 오가노이드는 ACCTUB 양성 또는 FOXJ1 양성 섬모 세포, P63 양성 기저 세포, CC10 양성 클럽 세포 및 MUC5AC 양성 잔 세포를 포함한 네 가지 주요 기도 상피 세포 유형을 모두 조기 상태로 보유했다. 확장 및 근위 분화 배지에서 배양된 오가노이드는 시간이 지남에 따라 뚜렷한 형태학을 발전시켰다.근위 분화 배지에서 분화 두 주 후, 모타일 섬모는 모든 오르가노이드에서 식별가능하였다. 동시적으로 박동하는 셀리아가 오가노이드 루멘 내부의 세포 파편을 몰고 흡입 된 입자를 제거하기 위해 일방향으로 소용돌이 치는 것이 관찰되었습니다. 또한, 유세포 분석 결과, 분화된 오가노이드가 근위 분화 및 확장 배지에서 네 가지 기도 상피 세포 유형을 수용한다는 것을 입증하였다.분화 2 주 후, 2D 기도 오가노이드는 손상되지 않은 상피 장벽을 개발했습니다. 덱스트란 막힘 분석은 2D 기도 오가노이드에서 형성된 상피 장벽의 완전성을 평가하기 위해 수행되었다. 2D 오가노이드는 풍부한 섬모 세포를 함유했다.장기간 확장 가능한 폐 오가노이드와 차별화된 기도 오가노이드는 COVID-19를 포함한 호흡기 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 생리활성 및 보편적인 모델 시스템을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...