Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Vi takker Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, for hjelp til konfektavbildning og strømningscytometri. Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 og 19180392) fra Food and Health Bureau; Forskningsrådets generelle forskningsfond (GRF, 17105420). og Health@InnoHK, innovasjons- og teknologikommisjonen, regjeringen i Hong Kongs spesielle administrative region.

All eksperimentering ved hjelp av humant vev beskrevet her ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Hong Kong / Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 og UW21-695). Informert samtykke ble innhentet fra pasienter før vevsinnsamling.
1. Avledning av human lungeorganoid
<ol><li>Utarbeidelse av eksperimentelle materialer<ol>
<li>Forbered basal medium ved å supplere avansert DMEM / F12 medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

De menneskelige luftveiene er foret med luftveisepitelet, også kjent som pseudostratifisert ciliated epitel. De viktigste celletypene av det øvre luftveisepitelet er ciliated celler som gjør det mulig for koordinert bevegelse av deres apikale cilia å utvise slim og inhalerte partikler fra luftveiene, begerceller som produserer og utskiller slim og basale celler som ligger i kjellermembranen og er involvert i regenerering. I den lille luftveien som bronkioler inneholder det cuboidale luftveisepitelet sekretoriske klub...

Organoider har blitt et robust og universelt verktøy for in vitro modellering av organutvikling og studier av biologi og sykdom. Når de dyrkes i et vekstfaktordefinert kulturmedium, kan voksne stamceller (ASC) fra en rekke organer utvides i 3-dimensjon (3D) og selvmontert i organlignende cellulære klynger sammensatt av flere celletyper, kalt organoider. Clevers' laboratorium rapporterte avledningen av den første ASC-avledede organoiden, humant tarmorganoid, i 2009 1,2. Etterpå er ASC-avledede organoider etablert for en rekke menneskelige organer og vev, inkludert prostata 3,4, lever 5,6, mage 7,8,9, bukspyttkjertel10, brystkjertel11 og lunge 12,13 . Disse ASC-avledede organoidene beholdt de kritiske cellulære, strukturelle og funksjonelle egenskapene til det opprinnelige organet og opprettholdt genetisk og fenotypisk stabilitet i langsiktig ekspansjonskultur14,15.
Organoider kan også avledes fra pluripotente stamceller (PSC), inkludert embryonale stammeceller (ES) og indusert pluripotentstamme (iPS) celle16. Mens PSC-avledede organoider utnytter mekanismene for organutvikling for etableringen, kan ASC-er tvinges til å danne organoider ved å gjenoppbygge forhold som etterligner stamcellenisjen under fysiologisk vev selvfornyelse eller vevsreparasjon. PSC-avledede organoider er gunstige modeller for å utforske utvikling og organogenese, om enn ikke i stand til å nå det sammenlignbare modningsnivået til ASC-avledede organoider. Fosterlignende modningsstatus for PSC-avledede organoider, og kompleksitet for å etablere disse organoidene forhindrer betydelig deres brede anvendelser for å studere biologi og patologi i modne vev.
Den menneskelige luftveiene, fra nese til terminal bronkiol, er foret med luftveisepitelet, også kalt pseudostratifisert ciliated epitel, som består av fire store celletyper, det vil si ciliated celle, begercelle, basalcelle og klubbcelle. Vi etablerte den ASC-avledede humane lungeorganoiden fra humant lungevev i samarbeid med Clevers' lab12,13. Disse lungeorganoidene utvides fortløpende i ekspansjonsmediet i over et år; den nøyaktige varigheten varierer mellom ulike organoidlinjer hentet fra forskjellige givere. Men sammenlignet med det opprinnelige luftveisepitelet, er disse langsiktige utvidbare lungeorganoidene ikke modne nok siden ciliated celler, den store cellepopulasjonen i den menneskelige luftveien, er underrepresentert i disse lungeorganoidene. Dermed utviklet vi en proksimal differensieringsprotokoll og genererte 3D- og 2D-luftveisorganoider som morfologisk og funksjonelt fenokopierer luftveisepitelet til et nesten fysiologisk nivå.
Her gir vi en videoprotokoll for å utlede humane lungeorganoider fra det primære lungevevet, utvide lungeorganoidene og indusere proksimal differensiering for å generere 3D- og 2D-luftveisorganoider.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

Mangelen på en robust in vitro-modell av det menneskelige respiratoriske epitelet hindrer forståelsen av biologien og patologien i luftveiene. Vi beskriver en definert protokoll for å utlede humane lungeorganoider fra voksne stamceller i lungevevet og indusere proksimal differensiering for å generere modne luftveisorganoider. Lungeorganoidene utvides deretter fortløpende i over 1 år med høy stabilitet, mens de differensierte luftveisorganoidene brukes til å morfologisk og funksjonelt simulere humant luftveisepiteli til et nesten fysiologisk nivå. Dermed etablerer vi en robust organoid modell av det menneskelige luftveisepitelet. Den langsiktige utvidelsen av lungeorganoider og differensierte luftveisorganoider genererer en stabil og fornybar kilde, slik at forskere kan rekonstruere og utvide de menneskelige luftveisepitelcellene i kulturretter. Det humane lungeorganoidsystemet gir en unik og fysiologisk aktiv in vitro-modell for ulike bruksområder, inkludert studier av virusvertsinteraksjon, legemiddeltesting og sykdomsmodellering.

Denne protokollen muliggjør avledning av humane lungeorganoider med høy suksessrate. Friskt humant lungevev blir hakket i små biter, og deretter dekomponert med kollagenaliser. De resulterende enkeltcellene er innebygd i kjellermatrisen og inkuberes i lungeorganoid ekspansjonsmediet supplert med en cocktail av nisjefaktorer for utvekst av epitelceller (trinn 1.1.2). Figur 1 viser mikrofotografen til nyisolerte lungeceller innebygd i redusert vekstfaktor kjellermembranmatrise Type 2 (BME; ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

Protokollen presenterer en metode for å utlede humane lungeorganoider fra primære lungevev, utvide lungeorganoidene og indusere proksimal differensiering for å generere 3D- og 2D-luftveisorganoider som trofast fenokopierer det menneskelige luftveisepitelet.

Etablering av humane lungeorganoider og proksimal differensiering for å generere modne luftveisorganoider

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Vi introduserer en metode for å etablere den organoide kulturen til humant luftveisepitel i kulturplater. Vi henter human lungeorganoid direkte fra primær lungevev med høy effektivitet. Den avledede humane lungeorganoiden er stabilt utvidet i over ett år, og en proksimal differensieringsprotokoll tillater generering av modne luftveisorganoider som trofast kan simulere det menneskelige luftveisepitelet til et nær fysiologisk nivå.Derfor tillater kultursystemet forskere å rekonstruere og utvide det menneskelige luftveisepitelet i kulturplater. Demonstrere prosedyren vil være Man Chun Chiu og Yifei Yu, PhD studenter i vårt laboratorium For å begynne celleisolasjonen fra menneskelig lungevev for 3D organoid kultur, hakk lungevevet i en millimeter små biter med en steril skalpell og vask vevsstykkene med 10 milliliter kaldt basalmedium. Sentrifuger vevet ved 400 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten før du bruker pelletsen på nytt i åtte milliliter basalmedium supplert med kollagenal ved en endelig konsentrasjon på to milligram per milliliter.Deretter fordøyer vevsstykkene ved å riste røret ved 120 RPM i 30 til 40 minutter ved 37 grader Celsius. Etter fordøyelsen, pipette opp og ned 20 ganger ved hjelp av en 10 milliliter serologisk pipette for å skjære de fordøyde vevsstykkene. Deretter filtrerer du suspensjonen med en 100-mikron sil inn i et 50 milliliterrør.Gjenopprett og overfør vevsstykkene fra silen til et 15 milliliter sentrifugerør med basalmediet. For å avslutte fordøyelsen, legg til foster bovint serum til gjennomstrømningen til en endelig konsentrasjon på 2%Deretter sentrifugerer røret og bruker cellepelleten på nytt i 10 milliliter av basalmediet som beskrevet tidligere. Etter sentrifugering, resuspend pellet i 80 til 160 mikroliter av kald kjeller matrise medium og plassere rørene på is.Deretter dispenserer du 40 mikroliter av suspensjonen til hver brønn av en forhåndsvarmet 24-brønns fjæringskulturplate. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 10 til 15 minutter. La kjellermatrisen størkne og danne en dråpe.Etter inkubasjon, tilsett 500 mikroliter av humane lungeorganoider ekspansjonsmedium supplert med fem nanomolar av hergulin-beta 1 til hver brønn og inkuber platen i en cellekulturinkubator. Etter tre dager, fjern det gamle mediet mens du holder dråpen intakt og legg forsiktig til friskt medium. Etter 10 til 14 dager med passivitet, observere organoidene under et mikroskop og sørg for at organoidene ikke er innebygd med en svært høy celletetthet.For å passere lungeorganoidene med skjæring, bryt dråpene ved å pipettere opp og ned med en en milliliterspiss. Overfør deretter organoidene sammen med mediet til et 15 milliliter sentrifugerør og juster volumet til 10 milliliter med et kaldt basalmedium. Sentrifuger røret ved 300 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius, kast supernatanten og vask organoidene med 10 milliliter kaldt basalmedium.Deretter resuspenderer organoidene i to milliliter kaldt basalmedium og skjærer i små biter med en Pasteur pipette. Deretter legger du til basalmedium til et totalt volum på 10 milliliter og sentrifuger før du bruker organoidfragmentene på nytt med en kald kjellermatrise som er tilstrekkelig til å muliggjøre en 1:3 til 1:5-utvidelse og plassere rørene på is. Dispenser 40 mikroliter organoid suspensjon i hver brønn av en forvarmet 24-brønns plate for å inkubere ved 37 grader Celsius for å la kjellermatrisen størkne i 10 til 15 minutter.Senere legger du til 500 mikroliter lungeorganoid ekspansjonsmedium til hver brønn og inkuberer i en cellekulturinkubator. Oppdater mediet hver tredje dag og passer organoidene annenhver uke. For å passere lungeorganoider med trypsinisering, resuspend høstet lungeorganoider i en milliliter dissosiasjonsenzym.Inkuber organoiden i et 37-graders Celsius vannbad i tre til fem minutter. Tilsett deretter en milliliter basal medium til røret og skjær organoidene mekanisk ved å pipettere opp og ned. Kontroller størrelsen på organoide stykker under et mikroskop ved 100X forstørrelse før du avslutter fordøyelsen med 40 mikroliter fosterbovin serum.Utgjør volumet til 10 milliliter med basal medium og sentrifuge før du bruker organoidstykkene i en kald kjellermatrise med et volum som er tilstrekkelig til å passere med et forhold på 1:5 til 1:10. Senere dispenserer du 40 mikroliter organoid suspensjon i hver brønn av en 24-brønns plate og kultur platen som vist før. For å generere 3D luftveisorganoider, inkubere lungeorganoidene i ekspansjonsmediet i syv til 10 dager etter passivring via mekanisk skjæring.Deretter erstatter du ekspansjonsmediet med proksimal differensieringsmedium og inkuberer organoidene i en cellekulturinkubator. Etter 14 dager, kast mediet i hver brønn og tilsett cellelysebuffer for å høste den differensierte luftveisorganoiden for RNA-ekstraksjon og påvisning av cellulært genuttrykk ved RT-qPCR-analyse. Inkuber innsatsene i cellekulturinkubatoren med henholdsvis 250 og 500 mikroliter av basalmediet i topp- og bunnkammeret på en 24-brønns plate.Deretter legger du til en milliliter basal medium til røret og pipetten opp og ned for å skjære organoidene inn i enkeltceller. Vær oppmerksom på cellene under et mikroskop før du avslutter fordøyelsen med 40 mikroliter foster bovint serum. Filtrer cellene gjennom en 40-mikron sil inn i et 50 milliliter rør og overfør den filtrerte cellefjæringen til et 15 milliliterrør.Fyll opp suspensjonen med basalmedium til et totalt volum på 10 milliliter. Etter sentrifugering, resuspend pellet samlet fra 24 dråper i 1 til 2,5 milliliter lunge organoid ekspansjonsmedium, avhengig av celletetthet. Tell antall celler med celletelleren under et mikroskop, og juster deretter cellekonsentrasjonen til 1,3 ganger 10 til seks per milliliter for 24-brønns innsatser.Fjern basalmediet fra topp- og bunnkamrene før du tilsetter 500 mikroliter ekspansjonsmedium i bunnkammeret. Frø 100 mikroliter cellefjæring fremstilt tidligere på det apikale kammeret til 24-brønnsinnsatsen og inkuberer. Etter to dager, erstatt ekspansjonsmediet med proksimal differensieringsmedium i både det apikale og nederste kammeret på platen.Inkuber organoidene i 14 dager og oppdater mediet hver tredje dag. Mål den transepitele elektriske motstanden hver dag ved hjelp av et målesystem for elektrisk motstand. I den representative mikrofotografen kan de nyisolerte lungecellene ses innebygd i redusert vekstfaktor kjellermembranmatrise type to.Cystiske organoider ble dukket opp og vokst over tid. Lungeorganoidene etter fjerde passasje er demonstrert her. Innen to timer etter mekanisk skjæring dannet organoidfragmentene innebygd i kjellermembranekstraktet cystiske domener.Mikrofotografen på samme felt på dag fem bekreftet organoid vekst over tid. De ekspanderende organoidene inneholdt alle de fire store luftveis epitelcelletypene, inkludert ACCTUB-positiv eller FOXJ1-positiv ciliated celle, P63-positiv basalcelle, CC10-positiv klubbcelle og MUC5AC-positiv begercelle i for tidlig tilstand. Organoidene inkubert i ekspansjons- og proksimal differensieringsmedie utviklet distinkt morfologi over tid.Etter to uker med differensiering i det proksimale differensieringsmediet var motil cilia merkbar i hvert organoid. Det ble observert at den synkront slående celia kjørte cellerester inne i organoid lumen og virvlet dem enveis for å fjerne de inhalerte partiklene. Videre viste strømningscytometrianalysen at de differensierte organoidene innkvarterte fire luftveis epitelcelletyper i proksimal differensiering og ekspansjonsmedium.Etter to uker med differensiering utviklet 2D luftveisorganoider en intakt epitelbarriere. En dextran blokkeringsanalyse ble utført for å vurdere integriteten til epitelbarrieren dannet i 2D luftveisorganoider. 2D-organoidene inneholdt rikelige ciliated celler.Den langsiktige utvidbare lungeorganoiden og den differensierte luftveisorganoiden gir et fysiologisk aktivt og universelt modellsystem for å studere respiratorisk biologi og patologi, inkludert COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokoll for Lentiviral Transduksjon og Nedstrøms Analyse av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Isolasjon og kultur av menneskelige modne adipocytter ved hjelp av membran modne adipocyte aggregerte kulturer (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellede oppløsning tredimensjonal avbildning av intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Culturing av organoider fra Intestinal Villi Epithelium Gjennomgår Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Etablering og genetisk manipulering av murin hepatocytt organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Bruk av presisjonskuttet lungeskive for å studere kontraktil regulering av luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskulatur

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med høy gjennomstrømning for kultur og 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablering av 3D Endometrial Organoids fra Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...