Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Agradecemos ao Centro de Ciências Panorômicas e Unidade de Microscópio Eletrônico, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Universidade de Hong Kong, pela assistência em imagens confocal e citometria de fluxo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Fundo de Pesquisa Médica e de Saúde (HMRF, 17161272 e 19180392) da Secretaria de Alimentação e Saúde; Fundo Geral de Pesquisa (GRF, 17105420) do Conselho de Bolsas de Pesquisa; e Health@InnoHK, Comissão de Inovação e Tecnologia, o Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong.

Toda a experimentação usando tecidos humanos descritos aqui foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). O consentimento informado foi obtido dos pacientes antes da coleta de tecidos.
1. Derivação do organoide pulmonar humano
<ol><li>Preparação de materiais experimentais<ol>
<li>Prepare o meio basal suplementando médio avançado DMEM/F12 com glutamina de 2 mM, HEPES d...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

As vias aéreas humanas são forradas com o epitélio das vias aéreas, também conhecido como epitélio ciliado pseudostratificado. Os principais tipos celulares do epitélio das vias aéreas superiores são células ciliadas que permitem o movimento coordenado de seus cílios apical para expelir muco e partículas inaladas das vias aéreas, células de cálice que produzem e secretam muco, e células basais que revestem a membrana do porão e estão implicadas na regeneração. Nas pequenas vias aéreas, como os brônq...

Os organoides tornaram-se uma ferramenta robusta e universal para a modelagem in vitro do desenvolvimento de órgãos e estudo da biologia e da doença. Quando cultivadas em um meio de cultura definido por fatores de crescimento, as células-tronco adultas (ASC) de uma variedade de órgãos podem ser expandidas em 3 dimensões (3D) e auto-montadas em aglomerados celulares semelhantes a órgãos compostos por múltiplos tipos de células, denominados organoides. O laboratório de Clevers relatou a derivação do primeiro organoide derivado do ASC, organoide intestinal humano, em 2009 1,2. Posteriormente, organoides derivados do ASC foram estabelecidos para uma variedade de órgãos e tecidos humanos, incluindo próstata 3,4, fígado 5,6, estômago 7,8,9, pâncreas10, glândula mamária11 e pulmão 12,13 . Esses organoides derivados do ASC mantiveram as propriedades críticas celulares, estruturais e funcionais do órgão nativo e mantiveram a estabilidade genética e fenotípica na cultura de expansão de longo prazo14,15.
Organoides também podem ser derivados de células-tronco pluripotentes (PSC), incluindo células de tronco embrionária (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS)16. Enquanto organoides derivados do PSC exploram os mecanismos de desenvolvimento de órgãos para seu estabelecimento, as ASCs podem ser coagidas a formar organoides por meio da reconstrução de condições que imitam o nicho de células-tronco durante a autoconexão do tecido fisiológico ou reparação de tecidos. Os organoides derivados do PSC são modelos favoráveis para explorar o desenvolvimento e a organogênese, embora incapazes de atingir o nível de maturação comparável dos organoides derivados do ASC. O estado de maturação fetal dos organoides derivados do PSC e a complexidade para o estabelecimento desses organoides impedem substancialmente suas amplas aplicações para estudar biologia e patologia em tecidos maduros.
O trato respiratório humano, do nariz ao brônquio terminal, é forrado com o epitélio das vias aéreas, também chamado de epitélio ciliado pseudostratificado, que consiste em quatro tipos principais de células, ou seja, célula ciliada, célula de cálice, célula basal e célula do clube. Estabelecemos o organoide pulmonar humano derivado do ASC a partir de tecidos pulmonares humanos em colaboração com o laboratório 12,13 da Clevers. Esses organoides pulmonares são consecutivamente expandidos no meio de expansão por mais de um ano; a duração precisa varia entre diferentes linhas organoides obtidas de diferentes doadores. No entanto, em comparação com o epitélio das vias aéreas nativas, esses organoides pulmonares expansíveis de longo prazo não são maduros o suficiente, uma vez que as células ciliadas, a maior população celular nas vias aéreas humanas, são sub-representadas nesses organoides pulmonares. Assim, desenvolvemos um protocolo de diferenciação proximal e geramos organoides das vias aéreas 3D e 2D que, morfologicamente e funcionalmente, fenóquico das vias aéreas, a um nível quase fisiológico.
Aqui fornecemos um protocolo de vídeo para derivar organoides pulmonares humanos dos tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides 3D e 2D das vias aéreas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

A falta de um modelo in vitro robusto do epitélio respiratório humano dificulta a compreensão da biologia e patologia do sistema respiratório. Descrevemos um protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos de células-tronco adultas no tecido pulmonar e induzir diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas. Os organoides pulmonares são então expandidos consecutivamente por mais de 1 ano com alta estabilidade, enquanto os organoides diferenciados das vias aéreas são usados para simular morfológica e funcionalmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico. Assim, estabelecemos um modelo organoide robusto do epitélio das vias aéreas humanas. A expansão a longo prazo de organoides pulmonares e organoides diferenciados das vias aéreas gera uma fonte estável e renovável, permitindo aos cientistas reconstruir e expandir as células epiteliais das vias aéreas humanas em pratos culturais. O sistema organoide pulmonar humano fornece um modelo in vitro único e fisiologicamente ativo para várias aplicações, incluindo o estudo da interação entre vírus e hospedeiros, testes medicamentosos e modelagem de doenças.

Este protocolo permite a derivação de organoides pulmonares humanos com uma alta taxa de sucesso. Tecido pulmonar humano fresco é picado em pequenos pedaços, e depois decomposto com colagemnase. As células únicas resultantes estão embutidas na matriz do porão e incubadas no meio de expansão organoide pulmonar complementada com um coquetel de fatores de nicho para o crescimento das células-tronco epiteliais (passo 1.1.2). A Figura 1 mostra a microfotografia de células pulmonares re...

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Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

O protocolo apresenta um método para derivar organoides pulmonares humanos de tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas 3D e 2D que ferem fielmente o epitélio das vias aéreas humanas.

Estabelecendo organoides pulmonares humanos e diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Estamos introduzindo um método para estabelecer a cultura organoide do epitélio das vias aéreas humanas em placas de cultura. Derivamos organoide pulmonar humano diretamente de tecidos pulmonares primários com alta eficiência. O organoide pulmonar humano derivado é expandido por mais de um ano, e um protocolo de diferenciação proximal permite a geração de organoides maduros das vias aéreas que podem simular fielmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico.Portanto, o sistema cultural permite que os cientistas reconstruam e expandam o epitélio das vias aéreas humanas em placas de cultura. Demonstrando o procedimento estarão Man Chun Chiu e Yifei Yu, estudantes de doutorado em nosso laboratório Para iniciar o isolamento celular dos tecidos pulmonares humanos para a cultura organoide 3D, pica os tecidos pulmonares em pequenos pedaços de um milímetro com um bisturi estéril e lave os pedaços de tecido com 10 mililitros de meio basal frio. Centrifugar os tecidos a 400 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenante antes de reutilizar a pelota em oito mililitros de meio basal suplementado com colagenase em uma concentração final de dois miligramas por mililitro.Em seguida, digerir os pedaços de tecido sacudindo o tubo a 120 RPM por 30 a 40 minutos a 37 graus Celsius. Após a digestão, pipeta para cima e para baixo 20 vezes usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros para tesourar os pedaços de tecido digerido. Em seguida, filtre a suspensão com um filtro de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros.Recupere e transfira as peças de tecido do coador para um tubo de centrífuga de 15 mililitros com o meio basal. Para terminar a digestão, adicione o soro bovino fetal ao fluxo até uma concentração final de 2%Em seguida, centrifugar o tubo e resuspengar a pelota celular em 10 mililitros do meio basal como descrito anteriormente. Após a centrifugação, resuspenja a pelota em 80 a 160 microliters de matriz de porão frio média e coloque os tubos no gelo.Em seguida, dispense 40 microliters da suspensão para cada poço de uma placa de cultura de suspensão pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Permita que a matriz do porão se solidifique e forme uma gota.Após a incubação, adicione 500 microliters de organoides pulmonares humanos meio de expansão complementado com cinco nanomolar de heregulin-beta 1 para cada poço e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular. Após três dias, remova o meio antigo mantendo a gota intacta e adicione cuidadosamente o meio fresco. Após 10 a 14 dias de passagem, observe os organoides sob um microscópio e certifique-se de que os organoides não estejam incorporados com uma densidade celular muito alta.Para passar os organoides pulmonares com cisalhamento, quebre as gotículas por pipetting para cima e para baixo com uma ponta de um mililitro. Em seguida, transfira os organoides junto com o tubo médio para um tubo centrífuga de 15 mililitros e ajuste o volume para 10 mililitros com um meio basal frio. Centrifugar o tubo a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, descartar o supernazio e lavar os organoides com 10 mililitros de meio basal frio.Em seguida, resuspenque os organoides em dois mililitros de meio basal frio e corte em pequenos pedaços com uma pipeta Pasteur. Em seguida, adicione meio basal a um volume total de 10 mililitros e centrífuga antes de reutilizar os fragmentos organoides com uma matriz fria de porão suficiente para permitir uma expansão de 1:3 a 1:5 e colocar os tubos no gelo. Dispense 40 microliters de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços para incubar a 37 graus Celsius para permitir que a matriz do porão se solidifique por 10 a 15 minutos.Posteriormente, adicione 500 microliters de meio de expansão organoide pulmonar a cada poço e incuba em uma incubadora de cultura celular. Refrescar o meio a cada três dias e passar os organoides a cada duas semanas. Para passagem de organoides pulmonares com trippsinização, resuspende colhiu organoides pulmonares colhidos em um mililitro de enzima dissociação.Incubar o organoide em um banho de água de 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio basal ao tubo e enlouco que os organoides mecanicamente tubos para cima e para baixo. Verifique o tamanho das peças organoides sob um microscópio a 100X de ampliação antes de terminar a digestão com 40 microlitros de soro bovino fetal.Coma o volume para 10 mililitros com meio basal e centrífuga antes de reutilizar as peças organoides em uma matriz fria de porão com volume suficiente para passagem com uma razão de 1:5 a 1:10. Mais tarde, dispense 40 microliters de suspensão organoide em cada poço de uma placa de 24 poços e cultua a placa como demonstrado anteriormente. Para gerar organoides das vias aéreas 3D, incubar os organoides pulmonares no meio de expansão por sete a 10 dias após a passagem via cisalhamento mecânico.Em seguida, substitua o meio de expansão por meio de diferenciação proximal e incubar os organoides em uma incubadora de cultura celular. Após 14 dias, descarte o meio em cada poço e adicione tampão de lise celular para colher o organoide diferenciado das vias aéreas para extração de RNA e detecção de expressão genética celular pelo ensaio RT-qPCR. Pré-incubar as pastilhas na incubadora de cultura celular com 250 e 500 microliters do meio basal na câmara superior e inferior de uma placa de 24 poços, respectivamente.Em seguida, adicione um mililitro de meio basal ao tubo e pipeta para cima e para baixo para transformar os organoides em células únicas. Observe as células sob um microscópio antes de terminar a digestão com 40 microlitros de soro bovino fetal. Filtre as células através de um filtro de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros e transfira a suspensão celular filtrada para um tubo de 15 mililitros.Cubra a suspensão com meio basal a um volume total de 10 mililitros. Após a centrifugação, resuspengue a pelota coletada de 24 gotículas em 1 a 2,5 mililitros de meio de expansão organoide pulmonar, dependendo da densidade celular. Conte o número de células com o contador celular sob um microscópio, em seguida, ajuste a concentração celular para 1,3 vezes 10 para seis por mililitro para inserções de 24 poços.Remova o meio basal das câmaras superior e inferior antes de adicionar 500 microliters de meio de expansão na câmara inferior. Sementes 100 microliters de suspensão celular preparados anteriormente na câmara apical da inserção e incubação de 24 poços. Após dois dias, substitua o meio de expansão por meio de diferenciação proximal tanto na câmara apical quanto inferior da placa.Incubar os organoides por 14 dias e refrescar o meio a cada três dias. Meça a resistência elétrica trans-epitelial todos os dias usando um sistema de medição de resistência elétrica. Na microfotografia representativa, as células pulmonares recém-isoladas podem ser vistas embutidas na matriz de membrana de porão do fator de crescimento reduzido tipo dois.Os organoides císticos apareceram e cresceram ao longo do tempo. Os organoides pulmonares após a quarta passagem são demonstrados aqui. Duas horas após a cisalhamento mecânico, os fragmentos organoides embutidos no extrato da membrana do porão formaram os domínios císticos.A microfotografia do mesmo campo no quinto dia confirmou o crescimento organoide ao longo do tempo. Os organoides em expansão abrigaram todos os quatro principais tipos de células epiteliais das vias aéreas, incluindo célula ciliada positiva ou FOXJ1 positiva, célula basal P63 positiva, célula do clube CC10 positivo e célula de cálice positiva MUC5AC em um estado prematuro. Os organoides incubados no meio de expansão e diferenciação proximal desenvolveram morfologia distinta ao longo do tempo.Após duas semanas de diferenciação no meio de diferenciação proximal, cílios motil eram perceptíveis em cada organoide. Observou-se que o espancamento sincronia celia levou os detritos celulares para dentro do lúmen organoide e rodou-os unidiretamente para remover as partículas inalações. Além disso, a análise da citometria de fluxo demonstrou que os organoides diferenciados acomodavam quatro tipos de células epiteliais das vias aéreas em meio de diferenciação e expansão proximal.Após duas semanas de diferenciação, organoides das vias aéreas 2D desenvolveram uma barreira epitelial intacta. Foi realizado um ensaio de bloqueio do Dextran para avaliar a integridade da barreira epitelial formada em organoides das vias aéreas 2D. Os organoides 2D continham células ciliadas abundantes.O organoide pulmonar expansível de longo prazo e o organoide diferenciado das vias aéreas fornecem um sistema modelo fisiologicamente ativo e universal para estudar biologia respiratória e patologia, incluindo o COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Biologia

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Isolamento e Cultura de Adipócitos Maduros Humanos Usando culturas agregadas de adipócitomaduros de membrana (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Culturação 3D de Organoides do Epitélio Intestinal Villi passando por Dediferente

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...