Name: establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids at JoVE.com

Agradecemos al Centro de Ciencias Panorómicas y a la Unidad de Microscopio Electrónico, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, por su asistencia en imágenes confocales y citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos del Fondo de Salud e Investigación Médica (HMRF, 17161272 y 19180392) de la Oficina de Alimentos y Salud; Fondo General de Investigación (GRF, 17105420) del Consejo de Becas de Investigación; y Health@InnoHK, Comisión de Innovación y Tecnología, el Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong.

Toda la experimentación con tejidos humanos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong / Autoridad Hospitalaria Hong Kong West Cluster (UW13-364 y UW21-695). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de la recolección de tejidos.
1. Derivación del organoide pulmonar humano
<ol><li>Preparación de materiales experimentales<ol>
<li>Prepare el medio basal complementando el medio DMEM/F12 ...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture.">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids.">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells.">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus.">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modelling+in+human+organoids.">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li><li>. Millicell ERS-2 User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5</a> (2021)</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098 (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li><li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt/beta-catenin+and+Wnt/PCP+signalling.">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li><li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin.">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li><li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors.">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li><li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells.">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li><li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation.">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li><li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+immunological+research.">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids.">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2.">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li><li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids.">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids.">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li><li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site.">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508 (2021).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes.">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID.">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li></ol>

Las vías respiratorias humanas están revestidas con el epitelio de las vías respiratorias, también conocido como epitelio ciliado pseudoestratificado. Los principales tipos de células del epitelio de las vías respiratorias superiores son las células ciliadas que permiten el movimiento coordinado de sus cilios apicales para expulsar el moco y las partículas inhaladas de las vías respiratorias, las células caliciformes que producen y secretan moco y las células basales que recubren la membrana basal y están imp...

Los organoides se han convertido en una herramienta robusta y universal para el modelado in vitro del desarrollo de órganos y el estudio de la biología y la enfermedad. Cuando se cultivan en un medio de cultivo definido por el factor de crecimiento, las células madre adultas (ASC) de una variedad de órganos pueden expandirse en 3 dimensiones (3D) y autoensamblarse en grupos celulares similares a órganos compuestos de múltiples tipos de células, denominados organoides. El laboratorio de Clevers informó de la derivación del primer organoide derivado de ASC, el organoide intestinal humano, en 2009 1,2. Posteriormente, se han establecido organoides derivados de ASC para una variedad de órganos y tejidos humanos, incluyendo próstata 3,4, hígado 5,6, estómago 7,8,9, páncreas10, glándula mamaria11 y pulmón 12,13 . Estos organoides derivados de ASC conservaron las propiedades celulares, estructurales y funcionales críticas del órgano nativo y mantuvieron la estabilidad genética y fenotípica en cultivos de expansión a largo plazo14,15.
Los organoides también pueden derivarse de células madre pluripotentes (PSC), incluidas las células madre embrionarias (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS)16. Mientras que los organoides derivados de PSC explotan los mecanismos de desarrollo de órganos para su establecimiento, los ASC pueden ser coaccionados para formar organoides mediante la reconstrucción de condiciones que imitan el nicho de células madre durante la autorrenovación fisiológica del tejido o la reparación de tejidos. Los organoides derivados de PSC son modelos favorables para explorar el desarrollo y la organogénesis, aunque no pueden alcanzar el nivel de maduración comparable de los organoides derivados de ASC. El estado de maduración similar al fetal de los organoides derivados de PSC y la complejidad para establecer estos organoides impiden sustancialmente sus amplias aplicaciones para estudiar la biología y la patología en tejidos maduros.
El tracto respiratorio humano, desde la nariz hasta el bronquiolo terminal, está revestido con el epitelio de las vías respiratorias, también llamado epitelio ciliado pseudoestratificado, que consta de cuatro tipos principales de células, es decir, células ciliadas, células caliciformes, células basales y células club. Establecimos el organoide pulmonar humano derivado de ASC a partir de tejidos pulmonares humanos en colaboración con el laboratorio12,13 de Clevers. Estos organoides pulmonares se expanden consecutivamente en el medio de expansión durante más de un año; la duración precisa varía entre las diferentes líneas organoides obtenidas de diferentes donantes. Sin embargo, en comparación con el epitelio nativo de las vías respiratorias, estos organoides pulmonares expandibles a largo plazo no son lo suficientemente maduros ya que las células ciliadas, la principal población celular en las vías respiratorias humanas, están subrepresentadas en estos organoides pulmonares. Así, desarrollamos un protocolo de diferenciación proximal y generamos organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenocopian morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias a un nivel casi fisiológico.
Aquí proporcionamos un protocolo de video para derivar organoides pulmonares humanos de los tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for lung organoid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-0</td>
			<td>70-80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-19</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin &#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td>5 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin1 (conditional medium)</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2634</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7980</td>
			<td>4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>7925</td>
			<td>1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10X Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>05001</td>
			<td>air liquid interface basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>air liquid interface maintenance supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1-800-992-2537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42093483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX31SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418BG040397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN black or ZEN blue software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>665970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50 ml conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L6BF5Z8118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5mm Trans-well</td>
			<td>StemCell Technology</td>
			<td>#38024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TFLR140-200-Q21190531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-378893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BA08003, 08004, 08005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab128190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-FOX J1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-9965-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-&#946;-tubulin 4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB4218-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1217701</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids

La falta de un modelo robusto in vitro del epitelio respiratorio humano dificulta la comprensión de la biología y la patología del sistema respiratorio. Describimos un protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos a partir de células madre adultas en el tejido pulmonar e inducir la diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias. Los organoides pulmonares se expanden consecutivamente durante más de 1 año con alta estabilidad, mientras que los organoides diferenciados de las vías respiratorias se utilizan para simular morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico. Así, establecemos un modelo organoide robusto del epitelio de la vía aérea humana. La expansión a largo plazo de los organoides pulmonares y los organoides diferenciados de las vías respiratorias genera una fuente estable y renovable, lo que permite a los científicos reconstruir y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias humanas en platos de cultivo. El sistema organoide pulmonar humano proporciona un modelo in vitro único y fisiológicamente activo para diversas aplicaciones, incluido el estudio de la interacción virus-huésped, las pruebas de medicamentos y el modelado de enfermedades.

Este protocolo permite la derivación de organoides pulmonares humanos con una alta tasa de éxito. El tejido pulmonar humano fresco se pica en trozos pequeños y luego se descompone con colagenasa. Las células individuales resultantes se incrustan en la matriz del basamento y se incuban en el medio de expansión organoide pulmonar complementado con un cóctel de factores de nicho para el crecimiento de células madre epiteliales (paso 1.1.2). La Figura 1 muestra la microfotografía de cél...

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Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

El protocolo presenta un método para derivar organoides pulmonares humanos a partir de tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenopicon fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas.

Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Estamos introduciendo un método para establecer el cultivo organoide del epitelio de la vía aérea humana en placas de cultivo. Derivamos organoides pulmonares humanos directamente de tejidos pulmonares primarios con alta eficiencia. Los organoides pulmonares humanos derivados se expanden de manera estable durante más de un año, y un protocolo de diferenciación proximal permite la generación de organoides maduros de las vías respiratorias que pueden simular fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico.Por lo tanto, el sistema de cultivo permite a los científicos reconstruir y expandir el epitelio de las vías respiratorias humanas en placas de cultivo. Demostrando el procedimiento estarán Man Chun Chiu y Yifei Yu, estudiantes de doctorado en nuestro laboratorio Para comenzar el aislamiento celular de los tejidos pulmonares humanos para el cultivo de organoides en 3D, picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños de un milímetro con un bisturí estéril y lavar los trozos de tejido con 10 mililitros de medio basal frío. Centrifugar los tejidos a 400 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante antes de volver a depositar el pellet en ocho mililitros de medio basal suplementado con colagenasa a una concentración final de dos miligramos por mililitro.Luego, digiera las piezas de tejido agitando el tubo a 120 RPM durante 30 a 40 minutos a 37 grados centígrados. Después de la digestión, binote hacia arriba y hacia abajo 20 veces usando una pipeta serológica de 10 mililitros para cortar las piezas de tejido digeridas. Luego, filtre la suspensión con un colador de 100 micras en un tubo de 50 mililitros.Recupere y transfiera las piezas de tejido del colador a un tubo centrífugo de 15 mililitros con el medio basal. Para terminar la digestión, agregue suero bovino fetal al flujo a través de una concentración final del 2% Luego, centrifugue el tubo y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros del medio basal como se describió anteriormente. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 80 a 160 microlitros de medio de matriz de sótano frío y coloque los tubos sobre hielo.A continuación, dispense 40 microlitros de la suspensión a cada pozo de una placa de cultivo de suspensión de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Permita que la matriz del sótano se solidifique y forme una gota.Después de la incubación, agregue 500 microlitros de medio de expansión de organoides pulmonares humanos suplementados con cinco nanomolares de heregulina beta 1 a cada pozo e incube la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de tres días, retire el medio viejo mientras mantiene la gota intacta y agregue cuidadosamente el medio fresco. Después de 10 a 14 días de pase, observe los organoides bajo un microscopio y asegúrese de que los organoides no estén incrustados con una densidad celular muy alta.Para pasar los organoides pulmonares con cizallamiento, rompa las gotas mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una punta de un mililitro. Luego, transfiera los organoides junto con el medio a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y ajuste el volumen a 10 mililitros con un medio basal frío. Centrifugar el tubo a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, desechar el sobrenadante y lavar los organoides con 10 mililitros de medio basal frío.Luego, resuspende los organoides en dos mililitros de medio basal frío y cizalla en trozos pequeños con una pipeta Pasteur. A continuación, agregue el medio basal a un volumen total de 10 mililitros y centrífuga antes de volver a depositar los fragmentos organoides con una matriz de basamento frío suficiente para permitir una expansión de 1: 3 a 1: 5 y coloque los tubos en hielo. Dispense 40 microlitros de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada para incubar a 37 grados Celsius para permitir que la matriz del sótano se solidifique durante 10 a 15 minutos.Más tarde, agregue 500 microlitros de medio de expansión organoide pulmonar a cada pozo e incube en una incubadora de cultivo celular. Refrescar el medio cada tres días y pasar los organoides cada dos semanas. Para pasar organoides pulmonares con tripsinización, resuspend extrajo organoides pulmonares en un mililitro de enzima de disociación.Incubar el organoide en un baño de agua de 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. Luego, agregue un mililitro de medio basal al tubo y corte los organoides mecánicamente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Verifique el tamaño de las piezas organoides bajo un microscopio a un aumento de 100X antes de terminar la digestión con 40 microlitros de suero fetal bovino.Enrasar el volumen hasta 10 mililitros con medio basal y centrífuga antes de volver a depositar las piezas organoides en una matriz de basamento frío con un volumen suficiente para pasar con una proporción de 1:5 a 1:10. Más tarde, dispensar 40 microlitros de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cultivar la placa como se demostró anteriormente. Para generar organoides 3D de las vías respiratorias, incube los organoides pulmonares en el medio de expansión durante siete a 10 días después del paso a través de la cizalladura mecánica.Luego, reemplace el medio de expansión con el medio de diferenciación proximal e incube los organoides en una incubadora de cultivo celular. Después de 14 días, deseche el medio en cada pocillo y agregue tampón de lisado celular para cosechar el organoide diferenciado de las vías respiratorias para la extracción de ARN y la detección de la expresión génica celular mediante el ensayo RT-qPCR. Preincuba los insertos en la incubadora de cultivo celular con 250 y 500 microlitros del medio basal en la cámara superior e inferior de una placa de 24 pocillos, respectivamente.Luego, agregue un mililitro de medio basal al tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en células individuales. Observe las células bajo un microscopio antes de terminar la digestión con 40 microlitros de suero fetal bovino. Filtre las células a través de un colador de 40 micras en un tubo de 50 mililitros y transfiera la suspensión de células filtradas a un tubo de 15 mililitros.Recarga la suspensión con medio basal hasta un volumen total de 10 mililitros. Después de la centrifugación, resuspender el pellet recogido de 24 gotas en 1 a 2,5 mililitros de medio de expansión organoide pulmonar, dependiendo de la densidad celular. Cuente el número de células con el contador celular bajo un microscopio, luego ajuste la concentración celular a 1.3 veces 10 a seis por mililitro para insertos de 24 pocillos.Retire el medio basal de las cámaras superior e inferior antes de agregar 500 microlitros de medio de expansión en la cámara inferior. Separe 100 microlitros de suspensión celular preparados anteriormente en la cámara apical del inserto de 24 pocillos e incuben. Después de dos días, reemplace el medio de expansión con un medio de diferenciación proximal tanto en la cámara apical como en la inferior de la placa.Incubar los organoides durante 14 días y refrescar el medio cada tres días. Mida la resistencia eléctrica transepitelial todos los días utilizando un sistema de medición de resistencia eléctrica. En la microfotografía representativa, las células pulmonares recién aisladas se pueden ver incrustadas en la matriz de membrana basal del factor de crecimiento reducido tipo dos.Los organoides quísticos fueron apareciendo y creciendo con el tiempo. Los organoides pulmonares después del cuarto pasaje se muestran aquí. A las dos horas de la cizalladura mecánica, los fragmentos organoides incrustados en el extracto de la membrana basal formaron los dominios quísticos.La microfotografía del mismo campo en el quinto día confirmó el crecimiento de organoides a lo largo del tiempo. Los organoides en expansión albergaban los cuatro tipos principales de células epiteliales de las vías respiratorias, incluidas las células ciliadas positivas para ACCTUB o FOXJ1 positivas, las células basales P63 positivas, las células club CC10 positivas y las células caliciformes positivas para MUC5AC en un estado prematuro. Los organoides incubados en el medio de expansión y diferenciación proximal desarrollaron una morfología distinta a lo largo del tiempo.Después de dos semanas de diferenciación en el medio de diferenciación proximal, los cilios móviles fueron discernibles en cada organoide. Se observó que la celia que golpeaba sincrónicamente conducía los desechos celulares dentro de la luz organoide y los arremolinaba unidireccionalmente para eliminar las partículas inhaladas. Además, el análisis de citometría de flujo demostró que los organoides diferenciados acomodaron cuatro tipos de células epiteliales de las vías respiratorias en el medio de diferenciación y expansión proximal.Después de dos semanas de diferenciación, los organoides de las vías respiratorias 2D desarrollaron una barrera epitelial intacta. Se realizó un ensayo de bloqueo de dextrano para evaluar la integridad de la barrera epitelial formada en organoides de las vías respiratorias 2D. Los organoides 2D contenían abundantes células ciliadas.El organoide pulmonar expandible a largo plazo y el organoide diferenciado de las vías respiratorias proporcionan un sistema modelo fisiológicamente activo y universal para estudiar la biología y la patología respiratorias, incluida la COVID-19.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Investigación

Biología

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Cultivo 3D de organoides del epitelio de las vellosidades intestinales sometidos a desdiferenciación

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...