Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
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这项研究由塞拉皮拉赫拉研究所、里约热内卢国家和平保护基金会、全国公民与技术发展委员会和巴西国家经济委员会（CAPES）资助。我们感谢安东尼奥·加林娜·菲略博士、莫妮卡·蒙特罗·洛梅利博士和克劳迪奥·马苏达博士对实验室设施的支持，以及玛莎·索伦森博士在改进本文方面提出的善意和宝贵的意见。

本议定书由研究中使用的动物伦理委员会CCS / UFRJ（CEUA-101 / 19）和美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南批准。坐骨神经从四个月大的雄性C57BL / 6小鼠中分离出来，根据机构指南通过宫颈脱位安乐死。方案步骤经过优化，以避免线粒体恶化。因此，在该方案中，在小鼠坐骨神经组织解剖和透化之前进行极谱法氧传感器的校准。
1. 试剂的制备
<ol><li>准备组?...

伴随神经病变的几种疾病或病症将线粒体功能障碍作为危险因素。评估周围神经的线粒体功能对于阐明线粒体在这些神经退行性疾病中的行为至关重要。由于分离方法的困难和材料的稀缺性，线粒体功能的评估是费力的。因此，开发不需要分离线粒体的组织透化技术至关重要。
为了评估透化组织中的线粒体功能，选择一种能够透化细胞质膜而不干扰细胞呼吸的化学物质至关?...

线粒体对于维持细胞活力至关重要，并执行许多细胞功能，如能量代谢（葡萄糖，氨基酸，脂质和核苷酸代谢途径）。作为活性氧（ROS）产生的主要部位，线粒体是细胞凋亡等几个细胞信号传导过程的核心，并参与铁硫（Fe-S）簇的合成，线粒体蛋白的导入和成熟，以及维持其基因组和核糖体1，2，3。线粒体膜动力学网络由融合和裂变过程控制，它们还具有质量控制和线粒体自噬4，5，6的机制。
线粒体功能障碍与几种病理状况的出现有关，例如癌症，糖尿病和肥胖症7。线粒体功能紊乱在影响中枢神经系统的神经退行性疾病中检测到，如阿尔茨海默病8，9，帕金森病10，11，肌萎缩性侧索硬化症12，13和亨廷顿舞蹈症14，15.在周围神经系统中，在免疫神经病变中观察到轴突线粒体功能的丧失，例如吉兰 - 巴雷综合征16，17，并且与轴突中的高线粒体ROS产生相关联，这些事件导致Schwann细胞中的MAP激酶激活18。这表明线粒体生理学可能不仅对位点特异性细胞至关重要，而且对整个组织也至关重要。在 HIV 相关的远端感觉多发性神经病 （HIV-DSP） 中，线粒体在转录的反式激活剂 （HIV-TAT） 蛋白允许 HIV 有效复制的机制中发挥作用，以及在 HIV 感染发病机制中的几个其他作用19，20。
坐骨神经线粒体生理学的评估已成为研究神经病变7，21，22的重要目标。在糖尿病性神经病变中，蛋白质组学和代谢组学分析表明，糖尿病中的大多数分子改变都会影响坐骨神经线粒体氧化磷酸化和脂质代谢7。这些变化似乎也是肥胖引起的糖尿病的早期迹象21。在化疗诱导的疼痛性神经病变的小鼠模型中，坐骨神经中的线粒体损伤被检测为氧化磷酸化22的减少，以及线粒体复合物活性，膜电位和ATP含量23的降低。然而，尽管一些小组引用了神经病变中的线粒体功能障碍，但这些研究仅限于线粒体复合物活性的测量，没有保留线粒体膜，缺乏线粒体完整性的评估或ATP含量的测量作为线粒体ATP产生的参数。一般来说，对线粒体耗氧量和ROS产生的正确评估需要通过在percoll/蔗糖梯度中的差异离心分离线粒体。线粒体的分离也可能是坐骨神经组织的限制因素，因为需要大量的组织以及线粒体的丢失和破坏。
本研究旨在提供一种测量线粒体生理学的方案，如坐骨神经中的线粒体耗氧量和ROS产生，保留线粒体膜并且不需要分离线粒体。该方案通过高分辨率呼吸测量（HRR）根据透化肌肉纤维24 中的耗氧量测量进行调整。该程序的优点是可以评估少量组织（例如坐骨神经）中的线粒体并 原位评估线粒体参数，从而保留线粒体环境，结构和生物能量谱，以获得生理上值得信赖的结果。坐骨神经通透后，用底物和抑制剂测定线粒体呼吸状态，以正确评估线粒体生物能量学和线粒体膜完整性的细胞色素c系数，为线粒体电子传递系统（ETS）评估和基本参数计算的步骤提供指导。这项研究可以为回答与坐骨神经代谢有关的病理生理学机制中的问题提供工具，例如周围神经病变。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

周围神经的线粒体功能障碍伴随着与周围神经病变相关的几种疾病，这些疾病可由多种原因引发，包括自身免疫性疾病，糖尿病，感染，遗传性疾病和肿瘤。评估小鼠周围神经中的线粒体功能可能具有挑战性，因为样本量小，组织中存在有限数量的线粒体以及髓鞘的存在。本工作中描述的技术通过使用适用于肌肉纤维的独特透化方案来评估坐骨神经线粒体功能，而不是从组织中分离线粒体，从而最大限度地减少了这些挑战。通过使用 Amplex Red/过氧化物酶测量荧光反应物的产生，并比较皂苷透化神经中的不同线粒体底物和抑制剂，可以同时检测线粒体呼吸状态、活性氧 （ROS） 和线粒体复合物的活性。因此，与通过其他技术评估线粒体功能相比，这里介绍的方法具有优势。

透化坐骨神经的线粒体氧消耗量如图 2所示。红色迹线表示每单位质量的O2 通量，以pmool/s.mg为单位。在用内源性底物（常规呼吸）记录基础氧消耗量后，注射琥珀酸盐（SUCC）以记录复合物II（琥珀酸脱氢酶）驱动的呼吸，导致耗氧速率增加。按顺序，加入饱和浓度的ADP，激活ATP合酶并驱动氧化磷酸化。这导致线粒体呼吸的磷酸化状态。磷酸化状态呼吸是指ATP合酶可?...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

高分辨率呼吸测量与荧光传感器相结合，可测定线粒体耗氧量和活性氧 （ROS） 生成。本方案描述了一种评估透化坐骨神经中线粒体呼吸频率和ROS产生的技术。

通过高分辨率呼吸测量法评估坐骨神经的线粒体功能

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

该协议允许通过分离的线粒体进行包扎来评估神经内的线粒体功能，这是一个具有挑战性的过程，在含有有限数量的线粒体的小组织中。该技术提供了在原位分析保存的线粒体中同时分析线粒体功能的可能性，例如氧气消耗和ROS的产生。具有多种底物、抑制剂和解耦合器设计方案。几种疾病共享线粒体功能，特别是由二型糖尿病或化疗引起的神经病变。在这些疾病中，线粒体氧化磷酸化的损害是决定疾病发展的唯一迹象。该方法提供了对神经生物学，生物化学和药理学的见解，研究了线粒体疾病机制，寻找治疗方法，例如线粒体助推器或改善的神经性疼痛。首先，通过将2.1毫升MR缓冲液移液到每个腔室中来校准氧传感器。用塞子将其关闭，并将空气吸入腔室，直到形成气泡。在校准模式下在37摄氏度下搅拌一小时，直到每个质量的氧通量稳定下来。使用HRR软件根据制造商的说明对极谱法氧传感器进行空气校准。对于组织制备，将坐骨神经放入培养皿中，有足够的TP缓冲液覆盖它。用镊子握住神经的一端，用另一对镊子水平拉出神经束。首先，将显示的组织转移到含有一毫升TP缓冲液的小培养皿中以进行组织透化。为了开始透化，用镊子将组织转移到另一个含有一毫升TP缓冲液的培养皿中，每毫升含有50微克皂苷。将板放入微孔板振荡器中，轻轻搅拌30分钟。然后，用镊子将组织转移到含有一毫升MR缓冲液的新鲜培养皿中，并使其轻轻搅拌10分钟。用镊子将组织转移到校准的HRR室中。用2.1毫升MR缓冲液填充HRR室。将 Amplex 红和过氧化物酶加入最终浓度分别为 5 微摩尔和每毫升 2 个单位。然后，加入可渗透的坐骨神经。安装仪器的荧光传感器。然后，关闭软件控制部分中的灯，然后单击连接到软件中的oxygraph“转到编辑方案”并插入组织重量。转到布局并选择每个单位样品的特定通量“选项。然后选择绘图以同时访问氧气消耗读数，并在需要时访问过氧化氢生产。等待大约 10 分钟。注入两个脉冲的过氧化氢，每个脉冲的最终浓度为260微摩尔，用于校准腔室。注入20微升琥珀酸盐，一种线粒体复合物II底物，以激活线粒体电子传递系统。加入20微升ADP以激活ATP合成。按顺序，加入5微升细胞色素c作为膜完整性的指示剂。用等分试样滴定每毫升少霉素0.2μg，直到没有观察到氧气消耗的进一步减少。用等分试样滴定每升FCCP0.5微摩尔，线粒体解偶联剂，直到没有观察到氧气消耗的进一步增加。为了结束实验，注入两微升抗霉素A，做最终浓度为5毫摩尔并等待流量稳定下来。转到命令栏。在软件中搜索多感官“。单击控制“然后按保存文件”并断开连接。打开保存的文件并选择每个质量托盘的氧通量，以获得实验耗氧结果。通过按Shift加鼠标左键手动选择注射之间的窗口。转到标记，然后选择统计数据以可视化每次注射底物，抑制剂和解耦合器方案的结果。对于过氧化氢生产，请使用放大器斜率迹线执行相同的程序。ATP合成酶活性促进的膜电位降低加速了氧气消耗。外源性细胞色素C的添加仅促进了对呼吸的最小刺激，证明了该制剂的线粒体外膜完整性。记录了绝对氧流量，仅观察到呼吸增加6.3%，表明组织制备质量良好。在为电子传输系统提供燃料的不同基板存在下同时测量氧气消耗量和ROS产生量。添加丙酮酸盐和苹果酸盐用于线粒体复合物I增加了呼吸。进一步添加琥珀酸盐用于复合物II也会增加氧气消耗。因此，可以测试其他基板。ROS的产生也增加了，表明氧气从电子传输系统中泄漏。在饱和浓度中添加二磷酸腺苷会增加氧气消耗，从而推动ATP的形成，并减少ROS的产生。相比之下，寡核苷酸滴定法减少了氧气消耗并增加了ROS的产生。这表明渗透的坐骨神经可以复制线粒体生理学中的标准关系。FCCP和视黄酮的加入与预期的氧通量变化一致，证实了线粒体生理学和生物能量谱保留在透化的坐骨神经中。最重要的一步是轻轻地准备组织切片，确保所有腔室开口都得到适当清洁。线粒体功能的改变可能是由于功能障碍或线粒体数量减少。因此，建议通过PCR进行合酶活性和线粒体DNA含量的确认。

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