Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Cette étude a été financée par l’Instituto Serrapilheira, la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) et le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Nous sommes reconnaissants au Dr Antonio Galina Filho, au Dr Monica Montero Lomeli et au Dr Claudio Masuda pour le soutien apporté aux installations de laboratoire, ainsi qu’au Dr Martha Sorenson pour leurs commentaires aimables et précieux dans l’amélioration de l’article.

Le présent protocole est approuvé par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux dans la recherche, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) et les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le nerf sciatique est isolé de souris mâles C57BL/6 âgées de quatre mois, euthanasiées par luxation cervicale conformément aux directives institutionnelles. Les étapes du protocole sont optimisées pour éviter la détérioration mitochondriale. Par conséquent...

Plusieurs maladies ou affections accompagnant les neuropathies ont un dysfonctionnement mitochondrial comme facteur de risque. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques est essentielle pour élucider comment les mitochondries agissent dans ces conditions neurodégénératives. L’évaluation de la fonction mitochondriale est laborieuse en raison de la difficulté de la méthode d’isolement et de la rareté du matériel. Ainsi, le développement de techniques de perméabilisation tiss...

Les mitochondries sont essentielles au maintien de la viabilité cellulaire et remplissent de nombreuses fonctions cellulaires telles que le métabolisme énergétique (voies de métabolisme du glucose, des acides aminés, des lipides et des nucléotides). En tant que site principal de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), les mitochondries sont au centre de plusieurs processus de signalisation cellulaire tels que l’apoptose et participent à la synthèse des amas fer-soufre (Fe-S), à l’importation et à la maturation des protéines mitochondriales et au maintien de leur génome et de leurs ribosomes 1,2,3. Le réseau de dynamique de la membrane mitochondriale est contrôlé par des processus de fusion et de fission, et ils ont également des machines pour le contrôle de la qualité et la mitophagie 4,5,6.
Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à l’apparition de plusieurs conditions pathologiques telles que le cancer, le diabète et l’obésité7. Des perturbations de la fonction mitochondriale sont détectées dans les troubles neurodégénératifs qui affectent le système nerveux central, comme dans la maladie d’Alzheimer 8,9, la maladie de Parkinson 10,11, la sclérose latérale amyotrophique 12,13 et la maladie de Huntington 14,15 . Dans le système nerveux périphérique, une perte de la fonction mitochondriale dans les axones est observée dans les neuropathies immunitaires, telles que le syndrome de Guillain-Barré16,17, et en association avec une production élevée de ROS mitochondrial dans les axones, ces événements conduisent à l’activation de la MAP Kinase dans les cellules de Schwann18. Cela démontre que la physiologie mitochondriale peut être essentielle non seulement pour une cellule spécifique au site, mais pour un tissu entier. Dans la polyneuropathie sensorielle distale associée au VIH (HIV-DSP), les mitochondries jouent un rôle dans le mécanisme par lequel la protéine trans-activateur de transcription (HIV-TAT) permet au VIH de se répliquer efficacement, ainsi que plusieurs autres rôles dans la pathogenèse de l’infection par le VIH19,20.
L’évaluation de la physiologie mitochondriale du nerf sciatique est devenue une cible essentielle pour étudier la neuropathie 7,21,22. Dans la neuropathie diabétique, les analyses protéomiques et métabolomiques suggèrent que la plupart des altérations moléculaires du diabète affectent la phosphorylation oxydative mitochondriale du nerf sciatique et le métabolisme des lipides7. Ces altérations semblent également être des signes précoces de diabète induit par l’obésité21. Dans un modèle murin de neuropathie douloureuse induite par la chimiothérapie, une altération mitochondriale du nerf sciatique est détectée comme une diminution de la phosphorylation oxydative22 et une réduction des activités des complexes mitochondriaux, du potentiel membranaire et de la teneur en ATP23. Cependant, bien que plusieurs groupes aient cité le dysfonctionnement mitochondrial dans les neuropathies, ces études se limitent aux mesures de l’activité dans les complexes mitochondriaux sans préservation des membranes mitochondriales, sans évaluation de l’intégrité mitochondriale ou mesures de la teneur en ATP comme paramètre de la production mitochondriale d’ATP. En général, une évaluation correcte de la consommation mitochondriale d’oxygène et de la production de ROS nécessite l’isolement des mitochondries par centrifugation différentielle dans un gradient percoll/saccharose. L’isolement des mitochondries peut également être un facteur limitant pour le tissu nerveux sciatique en raison de la grande quantité de tissu nécessaire et de la perte et de la perturbation des mitochondries.
La présente étude vise à fournir un protocole pour mesurer la physiologie mitochondriale comme la consommation d’oxygène mitochondrial et la production de ROS dans le nerf sciatique, en préservant les membranes mitochondriales et sans qu’il soit nécessaire d’isoler les mitochondries. Ce protocole est adapté des mesures de consommation d’oxygène dans les fibres musculaires perméabilisées24 par respirométrie à haute résolution (HRR). Les avantages de cette procédure sont la possibilité d’évaluer les mitochondries dans de petites quantités de tissus tels que le nerf sciatique et d’évaluer les paramètres mitochondriaux in situ, préservant ainsi l’environnement mitochondrial, la structure et le profil bioénergétique, pour obtenir un résultat physiologiquement fiable. Les états respiratoires mitochondriaux ont été déterminés avec des substrats et des inhibiteurs après la perméabilisation du nerf sciatique afin d’évaluer correctement la bioénergétique mitochondriale et le coefficient cytochrome c pour l’intégrité de la membrane mitochondriale, fournissant un guide pour les étapes de l’évaluation du système de transport d’électrons mitochondrial (ETS) et le calcul des paramètres essentiels. Cette étude peut fournir des outils pour répondre aux questions sur les mécanismes physiopathologiques dans lesquels le métabolisme du nerf sciatique est impliqué, tels que les neuropathies périphériques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

Le dysfonctionnement mitochondrial dans les nerfs périphériques accompagne plusieurs maladies associées à la neuropathie périphérique, qui peuvent être déclenchées par de multiples causes, notamment les maladies auto-immunes, le diabète, les infections, les troubles héréditaires et les tumeurs. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques de la souris peut être difficile en raison de la petite taille de l’échantillon, d’un nombre limité de mitochondries présentes dans le tissu et de la présence d’une gaine de myéline. La technique décrite dans ce travail minimise ces défis en utilisant un protocole de perméabilisation unique adapté de celui utilisé pour les fibres musculaires, pour évaluer la fonction mitochondriale du nerf sciatique au lieu d’isoler les mitochondries du tissu. En mesurant la production d’espèces réactives fluorimétriques avec Amplex Red/Peroxyidase et en comparant différents substrats mitochondriaux et inhibiteurs dans les nerfs perméabilisés par la saponine, il a été possible de détecter simultanément les états respiratoires mitochondriaux, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’activité des complexes mitochondriaux. Par conséquent, la méthode présentée ici offre des avantages par rapport à l’évaluation de la fonction mitochondriale par d’autres techniques.

La consommation mitochondriale d’oxygène par le nerf sciatique perméabilisé est représentée à la figure 2. La trace rouge représente le fluxd’O2 par unité de masse en pmol/s.mg. Après avoir enregistré une consommation basale d’oxygène avec des substrats endogènes (respiration de routine), du succinate (SUCC) est injecté pour enregistrer la respiration entraînée par le complexe II (succinate déshydrogénase), ce qui entraîne une augmentation du taux de consom...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Ce protocole permet l’évaluation de la fonction mitochondriale à l’intérieur du nerf par parcellation des mitochondries isolées, une procédure difficile dans un petit tissu qui contient un nombre limité de mitochondries. La technique offre la possibilité d’analyser simultanément les fonctions mitochondriales telles que la consommation d’oxygène et la production de ROS dans une mitochondrie préservée in situ. Avec plusieurs substrats, inhibiteurs et protocoles de conception de découpleurs.Plusieurs maladies partagent la fonction mitochondriale, en particulier les neuropathies induites par le diabète de type deux ou la chimiothérapie. Dans ces maladies, les altérations de la phosphorylation oxydative mitochondriale sont le seul signe qui dicte le développement de la maladie. Cette méthode fournit des informations sur la neurobiologie, la biochimie et la pharmacologie, avec l’étude des mécanismes de la maladie mitochondriale, la recherche de thérapies, telles que les boosters mitochondriaux ou la douleur neuropathique améliorée.Pour commencer, calibrez les capteurs d’oxygène en pipetant 2,1 millilitres de tampon MR dans chaque chambre. Fermez-le avec les bouchons et aspirez l’air dans la chambre jusqu’à ce qu’une bulle se forme. Remuer à 37 degrés Celsius pendant une heure en mode d’étalonnage jusqu’à ce que le flux d’oxygène par masse se stabilise.À l’aide du logiciel HRR, effectuez un étalonnage de l’air des capteurs d’oxygène polarographiques conformément aux instructions du fabricant. Pour la préparation des tissus, placez le nerf sciatique dans une boîte de Petri avec suffisamment de tampon TP pour le couvrir. Tenez une extrémité du nerf avec une pince et avec une autre paire de pinces, retirez les faisceaux nerveux horizontalement.Tout d’abord, transférez le tissu affiché dans un petit plat contenant un tampon TP millilitre pour la perméabilisation des tissus. Pour commencer la perméabilisation, transférez le tissu avec une pince dans un autre plat contenant un millilitre de tampon TP, contenant 50 microgrammes par millilitre de saponine. Placez la plaque dans un agitateur à microplaques et laissez-la remuer doucement pendant 30 minutes.Ensuite, transférez le tissu avec une pince dans un plat frais contenant un tampon MR d’un millilitre et laissez-le remuer doucement pendant 10 minutes. Transférer le tissu avec une pince dans une chambre HRR calibrée. Remplissez les chambres HRR avec 2,1 millilitres de tampon MR.Ajouter Amplex Red et peroxydase à une concentration finale de cinq micromolaires et de deux unités par millilitre, respectivement. Ensuite, ajoutez le nerf sciatique perméable. Fixez les capteurs fluorescents de l’instrument.Ensuite, éteignez les lumières dans la section de contrôle du logiciel et cliquez sur se connecter à l’oxygraphe"Aller à modifier les protocoles » dans le logiciel et insérez le poids du tissu. Allez dans la mise en page et choisissez l’option « flux spécifique par unité d’échantillon ». Sélectionnez ensuite des graphiques pour accéder simultanément à la lecture de la consommation d’oxygène et, si nécessaire, à la production de peroxyde d’hydrogène.Attendez environ 10 minutes. Injecter deux impulsions de peroxyde d’hydrogène, chacune à une concentration finale de 260 micromolaires pour l’étalonnage de la chambre. Injectez 20 microlitres de succinate, un substrat du complexe mitochondrial II, pour activer le système de transport d’électrons mitochondriaux.Ajouter 20 microlitres d’ADP pour activer la synthèse de l’ATP. Dans l’ordre, ajoutez cinq microlitres de cytochrome c comme indicateur de l’intégrité de la membrane. Titrer avec des aliquotes de 0,2 microgramme par millilitre d’oligomycine jusqu’à ce qu’aucune autre diminution de la consommation d’oxygène ne soit observée.Titrer avec des aliquotes de 0,5 micromoles par litre de FCCP, le découpleur mitochondrial, jusqu’à ce qu’aucune autre augmentation de la consommation d’oxygène ne soit observée. Pour terminer l’expérience, injectez deux microlitres d’antimycine A, faites une concentration finale de cinq millimolaires et attendez que le flux se stabilise. Accédez à la barre de commandes.Recherchez multisensoriel"dans le logiciel. Cliquez sur ctrl"puis appuyez sur enregistrer le fichier » et déconnectez-vous. Ouvrez le fichier enregistré et sélectionnez le flux d’oxygène par plateau de masse pour obtenir les résultats de la consommation expérimentale d’oxygène.Sélectionnez manuellement la fenêtre entre les injections en appuyant sur le bouton Maj+gauche de la souris. Accédez aux marques et sélectionnez les statistiques pour visualiser les résultats de chaque injection de substrats, d’inhibiteurs et de protocole de découpleur. Pour la production de peroxyde d’hydrogène, effectuez la même procédure avec la trace de pente de l’ampère.La diminution du potentiel membranaire favorisée par l’activité de l’ATP sythase a accéléré la consommation d’oxygène. L’ajout de cytochrome C exogène n’a favorisé qu’une stimulation minimale de la respiration, certifiant l’intégrité de la membrane externe mitochondriale pour cette préparation. Des flux absolus d’oxygène ont été enregistrés et seulement une augmentation de 6,3% a été observée dans la respiration, indiquant une bonne qualité de la préparation des tissus.La consommation d’oxygène et la production de ROS ont été mesurées simultanément en présence de différents substrats fournissant du carburant pour le système de transport d’électrons. L’ajout de pyruvate et de malate pour le complexe mitochondrial I a augmenté la respiration. Et l’ajout supplémentaire de succinate pour le complexe II augmente également la consommation d’oxygène.Par conséquent, d’autres substrats pourraient être testés. La production de ROS a également augmenté, indiquant la fuite d’oxygène du système de transport d’électrons. L’ajout d’adénosine diphosphate en concentration saturante a augmenté la consommation d’oxygène entraînant la formation d’ATP et diminuant la production de ROS.En revanche, le titrage oligo a diminué la consommation d’oxygène et augmenté la production de ROS. Cela suggérait que le nerf sciatique perméabilisé pourrait reproduire la relation standard dans la physiologie mitochondriale. L’ajout de FCCP et de rétinone, alignés sur les changements attendus du flux d’oxygène, confirme que la physiologie mitochondriale et le profil bioénergétique ont été préservés dans le nerf sciatique perméabilisé.L’étape la plus importante consiste à préparer doucement la section de tissu, à s’assurer que toutes les ouvertures de la chambre sont correctement nettoyées. Les altérations de la fonction mitochondriale pourraient être dues à un dysfonctionnement ou à un nombre mitochondrial inférieur. par conséquent, l’activité de la synthase citée et la confirmation de la teneur en ADN mitochondrial par PCR sont recommandées.

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