Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Diese Studie wurde finanziert vom Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Wir danken Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli und Dr. Claudio Masuda für die Unterstützung mit Laboreinrichtungen und Dr. Martha Sorenson für die freundlichen und wertvollen Kommentare zur Verbesserung des Artikels.

Das vorliegende Protokoll wird von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) und den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt. Der Ischiasnerv wird aus vier Monate alten männlichen C57BL / 6-Mäusen isoliert, die gemäß den institutionellen Richtlinien durch Zervixdislokation eingeschläfert werden. Die Protokollschritte sind optimiert, um eine Verschlechterung der Mitochondrien zu vermeiden. Daher wurde i...

Mehrere Krankheiten oder Zustände, die Neuropathien begleiten, haben eine mitochondriale Dysfunktion als Risikofaktor. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven ist unerlässlich, um aufzuklären, wie sich die Mitochondrien bei diesen neurodegenerativen Zuständen verhalten. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion ist aufgrund der Schwierigkeit der Isolationsmethode und der Materialknappheit mühsam. Daher ist die Entwicklung von Gewebepermeabilisierungstechniken, die keine Isolierung der Mi...

Mitochondrien sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und erfüllen zahlreiche Zellfunktionen wie den Energiestoffwechsel (Glukose-, Aminosäure-, Lipid- und Nukleotidstoffwechselwege). Als primärer Ort der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sind Mitochondrien in mehreren Zellsignalprozessen wie Apoptose von zentraler Bedeutung und beteiligen sich an der Synthese von Eisen-Schwefel (Fe-S) -Clustern, dem Import und der Reifung von mitochondrialen Proteinen sowie der Aufrechterhaltung ihres Genoms und ihrer Ribosomen 1,2,3. Das mitochondriale Membrandynamiknetzwerk wird durch Fusions- und Spaltungsprozesse gesteuert, und sie verfügen auch über Maschinen zur Qualitätskontrolle und Mitophagie 4,5,6.
Mitochondriale Dysfunktion ist mit dem Auftreten mehrerer pathologischer Zustände wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit verbunden7. Störungen der mitochondrialen Funktion werden bei neurodegenerativen Erkrankungen festgestellt, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie bei der Alzheimer-Krankheit 8,9, der Parkinson-Krankheit 10,11, der amyotrophen Lateralsklerose 12,13 und der Huntington-Krankheit 14,15 . Im peripheren Nervensystem wird ein Verlust der mitochondrialen Funktion in Axonen bei Immunneuropathien wie dem Guillain-Barré-Syndrom 16,17 beobachtet, und in Verbindung mit einer hohen mitochondrialen ROS-Produktion in Axonen führen diese Ereignisse zu einer MAP-Kinase-Aktivierung in Schwann-Zellen18. Dies zeigt, dass die mitochondriale Physiologie nicht nur für eine ortsspezifische Zelle, sondern für ein ganzes Gewebe unerlässlich sein kann. Bei der HIV-assoziierten distalen sensorischen Polyneuropathie (HIV-DSP) spielen Mitochondrien eine Rolle in dem Mechanismus, durch den das HIV-TAT-Protein (Transaktivator of Transkription) es HIV ermöglicht, sich effizient zu replizieren, sowie mehrere andere Rollen bei der HIV-Infektionspathogenese19, 20.
Die Beurteilung der mitochondrialen Physiologie des Ischiasnervs hat sich als wesentliches Ziel für die Untersuchung der Neuropathieherausgestellt 7,21,22. Bei der diabetischen Neuropathie deuten proteomische und metabolomische Analysen darauf hin, dass die meisten molekularen Veränderungen bei Diabetes die mitochondriale oxidative Phosphorylierung des Ischiasnervs und den Fettstoffwechselbeeinflussen 7. Diese Veränderungen scheinen auch frühe Anzeichen für einen durch Fettleibigkeit verursachten Diabeteszu sein 21. In einem Mausmodell der chemotherapieinduzierten schmerzhaften Neuropathie wird eine mitochondriale Beeinträchtigung des Ischiasnervs als Abnahme der oxidativen Phosphorylierung22 und eine Verringerung der Aktivitäten der mitochondrialen Komplexe, des Membranpotentials und des ATP-Gehalts23 nachgewiesen. Obwohl mehrere Gruppen mitochondriale Dysfunktion bei Neuropathien zitiert haben, beschränken sich diese Studien auf die Messungen der Aktivität in mitochondrialen Komplexen ohne Erhaltung der mitochondrialen Membranen, fehlende Bewertung der mitochondrialen Integrität oder Messungen des ATP-Gehalts als Parameter für die mitochondriale ATP-Produktion. Im Allgemeinen erfordert eine ordnungsgemäße Beurteilung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion die Isolierung von Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation in einem Percoll/Saccharose-Gradienten. Die Isolierung von Mitochondrien kann aufgrund der großen Menge an benötigtem Gewebe und des Verlusts und der Störung der Mitochondrien auch ein limitierender Faktor für Ischiasnervengewebe sein.
Die vorliegende Studie zielt darauf ab, ein Protokoll zur Messung der mitochondrialen Physiologie wie des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion im Ischiasnerv bereitzustellen, wobei die mitochondrialen Membranen erhalten bleiben und keine Mitochondrien isoliert werden müssen. Dieses Protokoll wird aus Sauerstoffverbrauchsmessungen in permeabilisierten Muskelfasern24 durch hochauflösende Respirometrie (HRR) angepasst. Die Vorteile dieses Verfahrens sind die Möglichkeit, Mitochondrien in kleinen Gewebemengen wie dem Ischiasnerv zu bewerten und mitochondriale Parameter in situ zu bewerten, wodurch die mitochondriale Umgebung, Struktur und das bioenergetische Profil erhalten bleiben, um ein physiologisch vertrauenswürdiges Ergebnis zu erhalten. Die mitochondrialen Atmungszustände wurden mit Substraten und Inhibitoren nach der Permeabilisierung des Ischiasnervs bestimmt, um die mitochondriale Bioenergetik und den Cytochrom-c-Koeffizienten für die Integrität der mitochondrialen Membran richtig zu beurteilen und einen Leitfaden für Schritte der Bewertung des mitochondrialen Elektronentransportsystems (ETS) und der Berechnung wesentlicher Parameter zu geben. Diese Studie kann Werkzeuge zur Beantwortung von Fragen in pathophysiologischen Mechanismen liefern, an denen der Ischiasnervenstoffwechsel beteiligt ist, wie z.B. periphere Neuropathien.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

Mitochondriale Dysfunktion in peripheren Nerven begleitet mehrere Krankheiten, die mit peripherer Neuropathie verbunden sind, die durch mehrere Ursachen ausgelöst werden können, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen, Erbkrankheiten und Tumoren. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven der Maus kann aufgrund der geringen Probengröße, einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien im Gewebe und des Vorhandenseins einer Myelinscheide eine Herausforderung darstellen. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik minimiert diese Herausforderungen, indem sie ein einzigartiges Permeabilisierungsprotokoll verwendet, das an das für Muskelfasern verwendete Protokoll angepasst ist, um die mitochondriale Funktion des Ischiasnervs zu beurteilen, anstatt die Mitochondrien vom Gewebe zu isolieren. Durch die Messung der fluorimetrischen reaktiven Speziesproduktion mit Amplex Red/Peroxidase und den Vergleich verschiedener mitochondrialer Substrate und Inhibitoren in saponin-permeabilisierten Nerven war es möglich, mitochondriale Atmungszustände, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivität von mitochondrialen Komplexen gleichzeitig nachzuweisen. Daher bietet die hier vorgestellte Methode Vorteile gegenüber der Beurteilung der mitochondrialen Funktion durch andere Techniken.

Der mitochondriale Sauerstoffverbrauch durch den permeabilisierten Ischiasnerv ist in Abbildung 2 dargestellt. Die rote Spur stellt denO2-Fluss pro Masseneinheit in pmol/s.mg dar. Nach der Erfassung eines basalen Sauerstoffverbrauchs mit endogenen Substraten (Routineatmung) wird Succinat (SUCC) injiziert, um die durch Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) angetriebene Atmung aufzuzeichnen, was zu einer Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs führt. In der Folge wird eine sättigende Kon...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Funktion innerhalb des Nervs durch Parzellierung der isolierten Mitochondrien, ein anspruchsvolles Verfahren in einem kleinen Gewebe, das eine begrenzte Anzahl von Mitochondrien enthält. Die Technik bietet die Möglichkeit, Mitochondrienfunktionen wie Sauerstoffverbrauch und ROS-Produktion gleichzeitig in einem konservierten Mitochondrien in situ zu analysieren. Mit mehreren Substraten, Inhibitoren und Entkoppler-Designprotokollen.Mehrere Krankheiten teilen sich die mitochondriale Funktion, insbesondere Neuropathien, die durch Typ-Zwei-Diabetes oder Chemotherapie induziert werden. Bei diesen Erkrankungen sind Beeinträchtigungen der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung das einzige Zeichen, das die Krankheitsentwicklung bestimmt. Diese Methode bietet Einblicke in die Neurobiologie, Biochemie und Pharmakologie, mit der Untersuchung von mitochondrialen Krankheitsmechanismen, der Suche nach Therapien wie mitochondrialen Boostern oder verbesserten neuropathischen Schmerzen.Kalibrieren Sie zunächst die Sauerstoffsensoren, indem Sie 2,1 Milliliter MR-Puffer in jede Kammer pipettieren. Schließen Sie es mit den Stopfen und saugen Sie Luft in die Kammer, bis sich eine Blase bildet. Im Kalibriermodus eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius umrühren, bis sich der Sauerstofffluss pro Masse stabilisiert hat.Mit der HRR-Software führen Sie eine Luftkalibrierung der polarographischen Sauerstoffsensoren gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Zur Gewebepräparation legen Sie den Ischiasnerv in eine Petrischale mit genügend TP-Puffer, um ihn zu bedecken. Halten Sie ein Ende des Nervs mit einer Pinzette und ziehen Sie mit einer anderen Pinzette die Nervenbündel horizontal heraus.Zuerst das angezeigte Gewebe in eine kleine Schale mit einem Milliliter TP-Puffer für die Gewebepermeabilisierung geben. Um mit der Permeabilisierung zu beginnen, übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine andere Schale, die einen Milliliter TP-Puffer enthält und 50 Mikrogramm pro Milliliter Saponin enthält. Legen Sie die Platte in einen Mikroplattenschüttler und lassen Sie sie 30 Minuten lang vorsichtig rühren.Anschließend das Gewebe mit einer Pinzette in eine frische Schale mit einem Milliliter MR-Puffer geben und 10 Minuten lang vorsichtig umrühren lassen. Überführen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kalibrierte HRR-Kammer. Füllen Sie die HRR-Kammern mit 2,1 Millilitern MR-Puffer.Fügen Sie Amplex Red und Peroxidase zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren bzw. zwei Einheiten pro Milliliter hinzu. Dann fügen Sie den durchlässigen Ischiasnerv hinzu. Befestigen Sie die Fluoreszenzsensoren des Instruments.Schalten Sie dann die Lichter im Steuerungsbereich der Software aus und klicken Sie in der Software auf "An Oxygraph anschließen"Gehen Sie zu Protokollen bearbeiten" und geben Sie das Gewebegewicht ein. Gehen Sie zum Layout und wählen Sie die Option "Spezifischer Fluss pro Sample". Wählen Sie dann Parzellen aus, um gleichzeitig auf die Sauerstoffverbrauchsanzeige und bei Bedarf auf die Wasserstoffperoxidproduktion zuzugreifen.Warten Sie ca. 10 Minuten. Injizieren Sie zwei Impulse Wasserstoffperoxid, jeder auf eine Endkonzentration von 260 Mikromolar zur Kalibrierung der Kammer. Injizieren Sie 20 Mikroliter Succinat, ein substrat des mitochondrialen Komplexes II, um das mitochondriale Elektronentransportsystem zu aktivieren.Fügen Sie 20 Mikroliter ADP hinzu, um die ATP-Synthese zu aktivieren. Fügen Sie in der Folge fünf Mikroliter Cytochrom c als Indikator für die Integrität der Membran hinzu. Titrieren Sie mit Aliquots von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin, bis keine weitere Abnahme des Sauerstoffverbrauchs mehr beobachtet wird.Titrieren Sie mit Aliquots von 0,5 Mikromol pro Liter FCCP, dem mitochondrialen Entkoppler, bis kein weiterer Anstieg des Sauerstoffverbrauchs beobachtet wird. Um das Experiment zu beenden, injizieren Sie zwei Mikroliter Antimycin A, machen Sie eine endgültige Konzentration von fünf Millimolar und warten Sie, bis sich der Fluss stabilisiert hat. Wechseln Sie zur Befehlsleiste.Suchen Sie nach "multisensory" in der Software. Klicken Sie auf "Steuerung", drücken Sie "Datei speichern" und trennen Sie die Verbindung. Öffnen Sie die gespeicherte Datei und wählen Sie den Sauerstofffluss pro Massenschalen aus, um die experimentellen Sauerstoffverbrauchsergebnisse zu erhalten.Wählen Sie das Fenster zwischen den Injektionen manuell aus, indem Sie die Umschalttaste und die linke Maustaste drücken. Gehen Sie zu Markierungen und wählen Sie Statistiken aus, um die Ergebnisse für jede Injektion von Substraten, Inhibitoren und Entkopplungsprotokollen zu visualisieren. Für die Wasserstoffperoxidproduktion führen Sie das gleiche Verfahren mit der Ampere-Steigungsspur durch.Die Abnahme des Membranpotentials, die durch die ATP-Sythase-Aktivität gefördert wird, beschleunigte den Sauerstoffverbrauch. Die Zugabe von exogenem Cytochrom C förderte nur eine minimale Stimulation der Atmung und bescheinigte die Integrität der mitochondrialen äußeren Membran für dieses Präparat. Absolute Sauerstoffflüsse wurden aufgezeichnet und nur ein Anstieg der Atmung um 6,3% beobachtet, was auf eine gute Qualität der Gewebepräparation hinweist.Der Sauerstoffverbrauch und die ROS-Produktion wurden gleichzeitig in Gegenwart verschiedener Substrate gemessen, die Brennstoff für das Elektronentransportsystem lieferten. Die Zugabe von Pyruvat und Malat für den mitochondrialen Komplex I erhöhte die Atmung. Und die weitere Zugabe von Succinat für Komplex II erhöht auch den Sauerstoffverbrauch.Daher konnten andere Substrate getestet werden. Die ROS-Produktion stieg ebenfalls, was auf das Austreten von Sauerstoff aus dem Elektronentransportsystem hinweist. Die Zugabe von Adenosindiphosphat in der Sättigungskonzentration erhöhte den Sauerstoffverbrauch, was die ATP-Bildung vorantrieb, und verringerte die ROS-Produktion.Im Gegensatz dazu verringerte die Oligotitration den Sauerstoffverbrauch und erhöhte die ROS-Produktion. Dies deutete darauf hin, dass der permeablisierte Ischiasnerv die Standardrelation in der mitochondrialen Physiologie replizieren könnte. Die Zugabe von FCCP und Retinon, abgestimmt auf die erwarteten Sauerstoffflussänderungen, bestätigt, dass die mitochondriale Physiologie und das bioenergetische Profil im permeablisierten Ischiasnerv erhalten blieben.Der wichtigste Schritt besteht darin, den Gewebeabschnitt vorsichtig vorzubereiten und sicherzustellen, dass alle Kammeröffnungen ordnungsgemäß gereinigt werden. Veränderungen der Mitochondrienfunktion können auf Funktionsstörungen oder eine niedrigere mitochondriale Zahl zurückzuführen sein. daher werden die zitierte Synthaseaktivität und die Bestätigung des mitochondrialen DNA-Gehalts durch PCR empfohlen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

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Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh

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Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

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Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

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High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

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Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...