Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
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इस अध्ययन को इंस्टीट्यूटो सेरापिलहेरा, फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डो रियो डी जनेरियो (एफएपीईआरजे), कॉन्सेल्हो नैशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो सिएंटिफिको ई टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू) और कोर्डेनाकाओ डी एपरफेइकोमेंटो डी पेस्सोल डी निवेल सुपीरियर-ब्रासिल द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम प्रयोगशाला सुविधाओं के साथ समर्थन के लिए डॉ एंटोनियो गैलिना फिल्हो, डॉ मोनिका मोंटेरो लोमेली और डॉ क्लाउडियो मसूदा और लेख में सुधार में दयालु और मूल्यवान टिप्पणियों के लिए डॉ मार्था सोरेनसन के आभारी हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल अनुसंधान में जानवरों के उपयोग पर आचार समिति, सीसीएस / यूएफआरजे (सीईयूए -101/19), और प्रयोगात्मक जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान दिशानिर्देशों द्वारा अनुमो?...

न्यूरोपैथी के साथ कई बीमारियों या स्थितियों में जोखिम कारक के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता होती है। परिधीय नसों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन यह स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है कि माइटो?...

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका व्यवहार्यता को बनाए रखने और ऊर्जा चयापचय (ग्लूकोज, अमीनो एसिड, लिपिड और न्यूक्लियोटाइड चयापचय मार्ग) जैसे कई सेल कार्यों को करने के लिए आवश्यक हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन की प्राथमिक साइट के रूप में, माइटोकॉन्ड्रिया एपोप्टोसिस जैसी कई सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं में केंद्रीय हैं और लौह-सल्फर (एफई-एस) क्लस्टर, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात और परिपक्वता के संश्लेषण में भाग लेते हैं, और उनके जीनोम और राइबोसोम 1,2,3 के रखरखाव में भाग लेते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली गतिशीलता नेटवर्क को संलयन और विखंडन प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और उनके पास गुणवत्ता नियंत्रण और माइटोफैगी 4,5,6 के लिए मशीनरी भी होती है।
माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता कैंसर, मधुमेह और मोटापे जैसी कई रोग स्थितियों की उपस्थिति से जुड़ी हुई है7. माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में गड़बड़ी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में पाई जाती है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करती है, जैसे अल्जाइमर रोग 8,9, पार्किंसंस रोग10,11, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस 12,13, और हंटिंगटन रोग14,15 . परिधीय तंत्रिका तंत्र में, अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का नुकसान प्रतिरक्षा न्यूरोपैथी में देखा जाता है, जैसे कि गुइलेन-बैरे सिंड्रोम16,17, और अक्षतंतु में उच्च माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस उत्पादन के सहयोग से, ये घटनाएं श्वान कोशिकाओं18 में एमएपी किनेज सक्रियण का कारण बनती हैं। यह दर्शाता है कि माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी न केवल साइट-विशिष्ट सेल के लिए, बल्कि पूरे ऊतक के लिए आवश्यक हो सकती है। एचआईवी से जुड़े डिस्टल संवेदी पॉलीन्यूरोपैथी (एचआईवी-डीएसपी) में, माइटोकॉन्ड्रिया की तंत्र में एक भूमिका होती है जिसके द्वारा प्रतिलेखन (एचआईवी-टीएटी) प्रोटीन का ट्रांस-एक्टिवेटर एचआईवी को कुशलतापूर्वक दोहराने की अनुमति देता है, साथ ही साथ एचआईवी संक्रमण रोगजनन19,20 में कई अन्य भूमिकाएं भी।
कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान का मूल्यांकन न्यूरोपैथी 7,21,22 की जांच के लिए एक आवश्यक लक्ष्य के रूप में उभरा है। मधुमेह न्यूरोपैथी में, प्रोटिओमिक और चयापचय विश्लेषण से पता चलता है कि मधुमेह में अधिकांश आणविक परिवर्तन कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और लिपिड चयापचय को प्रभावित करतेहैं 7. ये परिवर्तन मोटापे से प्रेरित मधुमेह के शुरुआती संकेत भी प्रतीत होते हैं21. कीमोथेरेपी-प्रेरित दर्दनाक न्यूरोपैथी के एक माउस मॉडल में, कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल हानि को ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन22 में कमी और माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स गतिविधियों, झिल्ली क्षमता और एटीपी सामग्री23 की कमी के रूप में पाया जाता है। हालांकि, हालांकि कई समूहों ने न्यूरोपैथी में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का हवाला दिया है, ये अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के संरक्षण के बिना माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों में गतिविधि के माप तक सीमित हैं, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता के मूल्यांकन या माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन के लिए एक पैरामीटर के रूप में एटीपी सामग्री के माप की कमी है। सामान्य तौर पर, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन के उचित मूल्यांकन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव की आवश्यकता होती है विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन एक परकोल / माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक के लिए एक सीमित कारक भी हो सकता है क्योंकि बड़ी मात्रा में आवश्यक ऊतक और माइटोकॉन्ड्रिया हानि और व्यवधान।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान को माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और कटिस्नायुशूल तंत्रिका में आरओएस उत्पादन के रूप में मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को संरक्षित करना और माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की आवश्यकता के बिना। इस प्रोटोकॉल को उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति (एचआरआर) द्वारा पारगम्य मांसपेशी फाइबर24 में ऑक्सीजन की खपत माप से अनुकूलित किया गया है। इस प्रक्रिया के फायदे कटिस्नायुशूल तंत्रिका जैसे ऊतक की छोटी मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया का मूल्यांकन करने और सीटू में माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों का मूल्यांकन करने की संभावना है, जिससे शारीरिक रूप से भरोसेमंद परिणाम प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पर्यावरण, संरचना और बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को संरक्षित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों को माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स और साइटोक्रोम सी गुणांक का ठीक से आकलन करने के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका पारगम्यता के बाद सब्सट्रेट और अवरोधकों के साथ निर्धारित किया गया था, जो माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ईटीएस) मूल्यांकन और आवश्यक मापदंडों की गणना के चरणों के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करता है। यह अध्ययन पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र में सवालों के जवाब देने के लिए उपकरण प्रदान कर सकता है जिसमें कटिस्नायुशूल तंत्रिका चयापचय को फंसाया जाता है, जैसे कि परिधीय न्यूरोपैथी।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

परिधीय तंत्रिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता परिधीय न्यूरोपैथी से जुड़ी कई बीमारियों के साथ होती है, जिसे ऑटोइम्यून बीमारियों, मधुमेह, संक्रमण, विरासत में मिले विकारों और ट्यूमर सहित कई कारणों से ट्रिगर किया जा सकता है। माउस परिधीय नसों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करना छोटे नमूना आकार, ऊतक में मौजूद माइटोकॉन्ड्रिया की सीमित संख्या और माइलिन म्यान की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस काम में वर्णित तकनीक ऊतक से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के बजाय कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए मांसपेशियों के तंतुओं के लिए उपयोग किए जाने वाले एक से अनुकूलित एक अद्वितीय पारगम्यता प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन चुनौतियों को कम करती है। पेरोक्सीडेज के साथ फ्लोरिमेट्रिक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन को मापने और सैपोनिन-पारगम्य नसों में विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट और अवरोधकों की तुलना करके, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन राज्यों, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), और माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों की गतिविधि का एक साथ पता लगाना संभव था। इसलिए, यहां प्रस्तुत विधि अन्य तकनीकों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के मूल्यांकन की तुलना में फायदे प्रदान करती है।

पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत चित्रा 2 में दर्शाया गया है। लाल ट्रेस पीएमओएल / एस.मिलीग्राम में ओ2 प्रवाह प्रति यूनिट द्रव्यमान का प्रतिनिधित्व ?...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

प्रतिदीप्ति सेंसर के लिए युग्मित उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पीढ़ी को निर्धारित करती है। वर्तमान प्रोटोकॉल पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर और आरओएस उत्पादन का आकलन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री द्वारा कटिस्नायुशूल तंत्रिका में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करना

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

यह प्रोटोकॉल पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के पार्सेलेशन द्वारा तंत्रिका के अंदर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के मूल्यांकन की अनुमति देता है, एक छोटे ऊतक में एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया जिसमें सीमित संख्या में माइटोकॉन्ड्रिया होता है। तकनीक सीटू में संरक्षित माइटोकॉन्ड्रिया में एक साथ ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन जैसे माइटोकॉन्ड्रिया कार्यों का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करती है। कई सब्सट्रेट, अवरोधक और अनकपलर डिजाइन प्रोटोकॉल के साथ।कई बीमारियां माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन साझा करती हैं, विशेष रूप से टाइप टू मधुमेह या कीमोथेरेपी से प्रेरित न्यूरोपैथी। इन बीमारियों में, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन की हानि एकमात्र संकेत है जो रोग के विकास को निर्धारित करती है। यह विधि न्यूरोबायोलॉजी, बायोकेमिस्ट्री और फार्माकोलॉजी में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, माइटोकॉन्ड्रियल रोग तंत्र की जांच के साथ, माइटोकॉन्ड्रियल बूस्टर या सुधारित न्यूरोपैथिक दर्द जैसे उपचारों की खोज करती है।शुरू करने के लिए, प्रत्येक कक्ष में एमआर बफर के 2.1 मिलीलीटर पाइपिंग द्वारा ऑक्सीजन सेंसर को कैलिब्रेट करें। इसे स्टॉपर्स के साथ बंद करें और एक बुलबुला बनने तक कक्ष में हवा खींचें। अंशांकन मोड में एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाओ जब तक कि प्रति द्रव्यमान ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर न हो जाए।एचआरआर सॉफ्टवेयर का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का वायु अंशांकन करता है। ऊतक की तैयारी के लिए, कटिस्नायुशूल तंत्रिका को कवर करने के लिए पर्याप्त टीपी बफर के साथ पेट्री डिश में रखें। संदंश के साथ तंत्रिका के एक छोर पकड़ो और संदंश की एक और जोड़ी के साथ क्षैतिज तंत्रिका बंडलों बाहर खींच।सबसे पहले, प्रदर्शित ऊतक को एक छोटे पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें ऊतक पारगम्यता के लिए एक मिलीलीटर टीपी बफर होता है। पारगम्यीकरण शुरू करने के लिए, संदंश के साथ ऊतक को टीपी बफर के एक मिलीलीटर युक्त किसी अन्य डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर सैपोनिन होता है। प्लेट को माइक्रोप्लेट शेकर में रखें और इसे धीरे-धीरे 30 मिनट तक हिलाने दें।फिर, संदंश के साथ ऊतक को एक मिलीलीटर एमआर बफर युक्त एक ताजा पकवान में स्थानांतरित करें, और इसे धीरे-धीरे 10 मिनट तक हलचल दें। एक कैलिब्रेटेड एचआरआर कक्ष के लिए संदंश के साथ ऊतक स्थानांतरण। एमआर बफर के 2.1 मिलीलीटर के साथ एचआरआर कक्षों को भरें।क्रमशः पांच माइक्रोमोलर, और प्रति मिलीलीटर दो इकाइयों की अंतिम एकाग्रता में एम्पलेक्स रेड और पेरोक्सीडेज जोड़ें। फिर, पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका जोड़ें। उपकरण के फ्लोरोसेंट सेंसर संलग्न करें।फिर, सॉफ़्टवेयर के नियंत्रण अनुभाग में रोशनी बंद करें और सॉफ़्टवेयर में ऑक्सीग्राफ "प्रोटोकॉल संपादित करने के लिए जाएं" से कनेक्ट करें पर क्लिक करें और ऊतक वजन डालें। लेआउट पर जाएं और प्रति यूनिट नमूना विशिष्ट प्रवाह चुनें"विकल्प। फिर ऑक्सीजन की खपत रीडआउट तक एक साथ पहुंचने के लिए भूखंडों का चयन करें, और यदि आवश्यक हो, तो हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पादन।लगभग 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के दो दालों को इंजेक्ट करें, प्रत्येक कक्ष के अंशांकन के लिए 260 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए। माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली को सक्रिय करने के लिए सक्सिनेट के 20 माइक्रोलीटर, एक माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स द्वितीय सब्सट्रेट इंजेक्ट करें।एटीपी संश्लेषण को सक्रिय करने के लिए एडीपी के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। अनुक्रम में, झिल्ली अखंडता के संकेतक के रूप में साइटोक्रोम सी के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। ओलिगोमाइसिन के प्रति मिलीलीटर 0.2 माइक्रोग्राम के विभाज्य के साथ टाइट्रेट जब तक कि ऑक्सीजन की खपत में कोई और कमी नहीं देखी जाती है।0.5 माइक्रोमोल्स प्रति लीटर एफसीसीपी, माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर के विभाज्य के साथ टाइट्रेट, जब तक कि ऑक्सीजन की खपत में कोई और वृद्धि नहीं देखी जाती है। प्रयोग को समाप्त करने के लिए एंटीमाइसिन ए के दो माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें, पांच मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता करें और प्रवाह को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें। कमांड बार पर जाएँ।मल्टीसेंसरी के लिए खोजें"सॉफ्टवेयर में। नियंत्रण पर क्लिक करें "फिर सहेजें फ़ाइल दबाएं" और डिस्कनेक्ट करें। सहेजी गई फ़ाइल खोलें और प्रयोगात्मक ऑक्सीजन खपत परिणाम प्राप्त करने के लिए द्रव्यमान ट्रे प्रति ऑक्सीजन प्रवाह का चयन करें।मैन्युअल रूप से शिफ्ट प्लस बाएं माउस बटन दबाकर इंजेक्शन के बीच खिड़की का चयन करें। चिह्नों पर जाएं, और सब्सट्रेट, अवरोधक और अनकपलर प्रोटोकॉल के प्रत्येक इंजेक्शन के परिणामों की कल्पना करने के लिए आँकड़ों का चयन करें। हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पादन के लिए amp ढलान ट्रेस के साथ एक ही प्रक्रिया करते हैं।एटीपी सिथेज़ गतिविधि द्वारा प्रचारित झिल्ली क्षमता में कमी ने ऑक्सीजन की खपत को तेज कर दिया। बहिर्जात साइटोक्रोम सी के अलावा श्वसन की केवल न्यूनतम उत्तेजना को बढ़ावा दिया, इस तैयारी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली अखंडता को प्रमाणित किया। निरपेक्ष ऑक्सीजन प्रवाह दर्ज किया गया था और श्वसन में केवल 6.3% की वृद्धि देखी गई थी, जो ऊतक तैयारी की अच्छी गुणवत्ता का संकेत देती है।ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन को इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली के लिए ईंधन प्रदान करने वाले विभिन्न सब्सट्रेट की उपस्थिति में एक साथ मापा गया था। माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स के लिए पाइरूवेट और मैलेट के अलावा मैंने श्वसन में वृद्धि की। और कॉम्प्लेक्स II के लिए सक्सिनेट के आगे जोड़ने से ऑक्सीजन की खपत भी बढ़ जाती है।इसलिए अन्य सब्सट्रेट का परीक्षण किया जा सकता है। आरओएस उत्पादन में भी वृद्धि हुई, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली से ऑक्सीजन के रिसाव का संकेत देता है। संतृप्त एकाग्रता में एडेनोसिन डिफॉस्फेट के अलावा एटीपी गठन को चलाने और आरओएस उत्पादन को कम करने के लिए ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई।इसके विपरीत, ओलिगो अनुमापन ने ऑक्सीजन की खपत को कम कर दिया और आरओएस उत्पादन में वृद्धि की। इसने सुझाव दिया कि पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका माइटोकॉन्ड्रियल शरीर विज्ञान में मानक संबंध को दोहरा सकती है। एफसीसीपी और रेटिनोन के अलावा, अपेक्षित ऑक्सीजन प्रवाह परिवर्तनों के साथ गठबंधन किया गया है, यह पुष्टि करता है कि माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी और बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को पारगम्य कटिस्नायुशूल तंत्रिका में संरक्षित किया गया था।सबसे महत्वपूर्ण कदम धीरे-धीरे ऊतक अनुभाग तैयार करना है, यह सुनिश्चित करना है कि सभी कक्ष के उद्घाटन ठीक से साफ किए गए हैं। माइटोकॉन्ड्रिया फ़ंक्शन में परिवर्तन शिथिलता या कम माइटोकॉन्ड्रियल संख्या के कारण हो सकता है। इसलिए पीसीआर द्वारा उद्धृत सिंथेज़ गतिविधि और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए सामग्री की पुष्टि की सिफारिश की जाती है।

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High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण और वितरण की उच्च-थ्रूपुट छवि-आधारित परिमाणीकरण

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

स्तनधारियों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए ऑक्सीजन-स्वतंत्र परख

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...