Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato da Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Siamo grati al Dr. Antonio Galina Filho, alla Dr. Monica Montero Lomeli e al Dr. Claudio Masuda per il supporto con le strutture di laboratorio, e alla Dr. Martha Sorenson per i commenti gentili e preziosi nel migliorare l'articolo.

Il presente protocollo è approvato dal Comitato etico sull'uso degli animali nella ricerca, CCS / UFRJ (CEUA-101/19) e dalle linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso di animali da esperimento. Il nervo sciatico è isolato da topi maschi C57BL/6 di quattro mesi, eutanasia per lussazione cervicale secondo le linee guida istituzionali. I passaggi del protocollo sono ottimizzati per evitare il deterioramento mitocondriale. Pertanto, in questo protocollo, la calibrazione dei sensori polarografici di ...

Diverse malattie o condizioni che accompagnano le neuropatie hanno la disfunzione mitocondriale come fattore di rischio. La valutazione della funzione mitocondriale nei nervi periferici è essenziale per chiarire come agiscono i mitocondri in queste condizioni neurodegenerative. La valutazione della funzione mitocondriale è laboriosa a causa della difficoltà del metodo di isolamento e della scarsità di materiale. Pertanto, lo sviluppo di tecniche di permeabilizzazione dei tessuti che non richiedono l'isolamento dei mi...

I mitocondri sono essenziali per mantenere la vitalità cellulare e svolgono numerose funzioni cellulari come il metabolismo energetico (vie metaboliche di glucosio, amminoacidi, lipidi e nucleotidi). Come sito primario della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), i mitocondri sono centrali in diversi processi di segnalazione cellulare come l'apoptosi e partecipano alla sintesi di cluster ferro-zolfo (Fe-S), all'importazione e alla maturazione delle proteine mitocondriali e al mantenimento del loro genoma e dei ribosomi 1,2,3. La rete dinamica della membrana mitocondriale è controllata da processi di fusione e fissione e dispone anche di macchinari per il controllo di qualità e mitofagia 4,5,6.
La disfunzione mitocondriale è associata alla comparsa di diverse condizioni patologiche come il cancro, il diabete e l'obesità7. Disturbi della funzione mitocondriale sono rilevati nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale, come nel morbo di Alzheimer 8,9, nel morbo di Parkinson10,11, nella sclerosi laterale amiotrofica12,13 e nella malattia di Huntington 14,15 . Nel sistema nervoso periferico, la perdita della funzione mitocondriale negli assoni è osservata nelle neuropatie immunitarie, come la sindrome di Guillain-Barré16,17, e in associazione con un'elevata produzione di ROS mitocondriale negli assoni, questi eventi portano all'attivazione della MAP Chinasi nelle cellule di Schwann18. Ciò dimostra che la fisiologia mitocondriale può essere essenziale non solo per una cellula sito-specifica, ma per un intero tessuto. Nella polineuropatia sensoriale distale associata all'HIV (HIV-DSP), i mitocondri hanno un ruolo nel meccanismo attraverso il quale il trans-attivatore della proteina di trascrizione (HIV-TAT) consente all'HIV di replicarsi in modo efficiente, così come molti altri ruoli nella patogenesi dell'infezione da HIV19,20.
La valutazione della fisiologia mitocondriale del nervo sciatico è emersa come un obiettivo essenziale per lo studio della neuropatia 7,21,22. Nella neuropatia diabetica, le analisi proteomiche e metabolomiche suggeriscono che la maggior parte delle alterazioni molecolari nel diabete influenzano la fosforilazione ossidativa mitocondriale del nervo sciatico e il metabolismo lipidico7. Queste alterazioni sembrano anche essere i primi segni del diabete21 indotto dall'obesità. In un modello murino di neuropatia dolorosa indotta dalla chemioterapia, la compromissione mitocondriale nel nervo sciatico viene rilevata come una diminuzione della fosforilazione ossidativa22 e una riduzione delle attività dei complessi mitocondriali, del potenziale di membrana e del contenuto di ATP23. Tuttavia, sebbene diversi gruppi abbiano citato la disfunzione mitocondriale nelle neuropatie, questi studi sono limitati alle misurazioni dell'attività nei complessi mitocondriali senza conservazione delle membrane mitocondriali, mancando la valutazione dell'integrità mitocondriale o le misurazioni del contenuto di ATP come parametro per la produzione di ATP mitocondriale. In generale, una corretta valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale e della produzione di ROS richiede l'isolamento dei mitocondri mediante centrifugazione differenziale in un gradiente percoll/saccarosio. L'isolamento dei mitocondri può anche essere un fattore limitante per il tessuto nervoso sciatico a causa della grande quantità di tessuto necessario e della perdita e interruzione dei mitocondri.
Il presente studio mira a fornire un protocollo per misurare la fisiologia mitocondriale come il consumo di ossigeno mitocondriale e la produzione di ROS nel nervo sciatico, preservando le membrane mitocondriali e senza la necessità di isolare i mitocondri. Questo protocollo è adattato dalle misurazioni del consumo di ossigeno nelle fibre muscolari permeabilizzate24 mediante respirometria ad alta risoluzione (HRR). I vantaggi di questa procedura sono la possibilità di valutare i mitocondri in piccole quantità di tessuto come il nervo sciatico e valutare i parametri mitocondriali in situ, preservando così l'ambiente mitocondriale, la struttura e il profilo bioenergetico, per ottenere un risultato fisiologicamente affidabile. Gli stati respiratori mitocondriali sono stati determinati con substrati e inibitori dopo permeabilizzazione del nervo sciatico per valutare correttamente la bioenergetica mitocondriale e il coefficiente del citocromo c per l'integrità della membrana mitocondriale, fornendo una guida per le fasi della valutazione del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETS) e il calcolo dei parametri essenziali. Questo studio può fornire strumenti per rispondere a domande sui meccanismi fisiopatologici in cui è implicato il metabolismo del nervo sciatico, come le neuropatie periferiche.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

La disfunzione mitocondriale nei nervi periferici accompagna diverse malattie associate alla neuropatia periferica, che può essere innescata da molteplici cause, tra cui malattie autoimmuni, diabete, infezioni, disturbi ereditari e tumori. Valutare la funzione mitocondriale nei nervi periferici del topo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni del campione, di un numero limitato di mitocondri presenti nel tessuto e della presenza di una guaina mielinica. La tecnica descritta in questo lavoro minimizza queste sfide utilizzando un protocollo di permeabilizzazione unico adattato da quello utilizzato per le fibre muscolari, per valutare la funzione mitocondriale del nervo sciatico invece di isolare i mitocondri dal tessuto. Misurando la produzione di specie reattive fluorimetriche con Amplex Red/Peroxidase e confrontando diversi substrati e inibitori mitocondriali nei nervi permeabilizzati alla saponina, è stato possibile rilevare contemporaneamente gli stati respiratori mitocondriali, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e l'attività dei complessi mitocondriali. Pertanto, il metodo qui presentato offre vantaggi rispetto alla valutazione della funzione mitocondriale con altre tecniche.

Il consumo di ossigeno mitocondriale da parte del nervo sciatico permeabilizzato è rappresentato nella Figura 2. La traccia rossa rappresenta il flusso di O2 per unità di massa in pmol/s.mg. Dopo aver registrato un consumo basale di ossigeno con substrati endogeni (respirazione di routine), il succinato (SUCC) viene iniettato per registrare la respirazione guidata dal complesso II (succinato deidrogenasi), con conseguente aumento del tasso di consumo di ossigeno. In sequenza, vi...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.

Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Questo protocollo consente la valutazione della funzione mitocondriale all'interno del nervo mediante parcellazione dei mitocondri isolati, una procedura impegnativa in un piccolo tessuto che contiene un numero limitato di mitocondri. La tecnica fornisce la possibilità di analizzare contemporaneamente le funzioni dei mitocondri come il consumo di ossigeno e la produzione di ROS in un mitocondrio conservato in situ. Con più substrati, inibitori e protocolli di progettazione uncoupler.Diverse malattie condividono la funzione mitocondriale, in particolare le neuropatie indotte dal diabete di tipo due o dalla chemioterapia. In queste malattie, le menomazioni della fosforilazione ossidativa mitocondriale sono l'unico segno che determina lo sviluppo della malattia. Questo metodo fornisce approfondimenti in neurobiologia, biochimica e farmacologia, con lo studio dei meccanismi della malattia mitocondriale, la ricerca di terapie, come i booster mitocondriali o il dolore neuropatico migliorato.Per iniziare, calibrare i sensori di ossigeno pipettando 2,1 millilitri di tampone MR in ciascuna camera. Chiudilo con i tappi e aspira l'aria nella camera fino a formare una bolla. Mescolare a 37 gradi Celsius per un'ora in modalità di calibrazione fino a quando il flusso di ossigeno per massa si stabilizza.Utilizzando il software HRR eseguire una calibrazione dell'aria dei sensori di ossigeno polarografici secondo le istruzioni del produttore. Per la preparazione dei tessuti, posizionare il nervo sciatico in una capsula di Petri con abbastanza tampone TP per coprirlo. Tenere un'estremità del nervo con una pinza e con un altro paio di pinze estrarre i fasci nervosi orizzontalmente.In primo luogo, trasferire il tessuto visualizzato in un piccolo piatto contenente un tampone TP millilitro per la permeabilizzazione dei tessuti. Per iniziare la permeabilizzazione, trasferire il tessuto con pinza su un altro piatto contenente un millilitro di tampone TP, contenente 50 microgrammi per millilitro di saponina. Posizionare la piastra in uno shaker a micropiastre e lasciarla mescolare delicatamente per 30 minuti.Quindi, trasferire il tessuto con una pinza in un piatto fresco contenente un tampone MR millilitro e lasciarlo mescolare delicatamente per 10 minuti. Trasferire il tessuto con pinza in una camera HRR calibrata. Riempire le camere HRR con 2,1 millilitri di buffer MR.Aggiungere Amplex Red e perossidasi a una concentrazione finale di cinque micromolari e due unità per millilitro, rispettivamente. Quindi, aggiungere il nervo sciatico permeabile. Collegare i sensori fluorescenti dello strumento.Quindi, spegni le luci nella sezione di controllo del software e fai clic su Connetti all'ossigrafo "Vai a modificare i protocolli" nel software e inserisci il peso del tessuto. Vai al layout e scegli l'opzione "flusso specifico per unità campione". Quindi selezionare i grafici per accedere contemporaneamente alla lettura del consumo di ossigeno e, se necessario, alla produzione di perossido di idrogeno.Attendere circa 10 minuti. Iniettare due impulsi di perossido di idrogeno, ciascuno ad una concentrazione finale di 260 micromolari per la calibrazione della camera. Iniettare 20 microlitri di succinato, un substrato del complesso mitocondriale II, per attivare il sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale.Aggiungere 20 microlitri di ADP per attivare la sintesi di ATP. In sequenza, aggiungere cinque microlitri del citocromo c come indicatore dell'integrità della membrana. Titolare con aliquote di 0,2 microgrammi per millilitro di oligomicina fino a quando non si osserva un'ulteriore diminuzione del consumo di ossigeno.Titolare con aliquote di 0,5 micromoli per litro FCCP, il disaccoppiatore mitocondriale, fino a quando non si osserva un ulteriore aumento del consumo di ossigeno. Per terminare l'esperimento iniettare due microlitri di antimicina A, fare una concentrazione finale di cinque millimolari e attendere che il flusso si stabilizzi. Vai alla barra dei comandi.Cerca multisensoriale"nel software. Fare clic su Control"quindi premere Salva file" e disconnettersi. Aprire il file salvato e selezionare il flusso di ossigeno per vassoi di massa per ottenere i risultati sperimentali del consumo di ossigeno.Selezionare manualmente la finestra tra le iniezioni premendo il tasto Maiusc più il pulsante sinistro del mouse. Vai ai segni e seleziona le statistiche per visualizzare i risultati per ogni iniezione di substrati, inibitori e protocollo di disaccoppiamento. Per la produzione di perossido di idrogeno eseguire la stessa procedura con la traccia di pendenza dell'amplificatore.La diminuzione del potenziale di membrana promossa dall'attività dell'ATP sisidasi ha accelerato il consumo di ossigeno. L'aggiunta del citocromo C esogeno ha promosso solo una stimolazione minima della respirazione, certificando l'integrità della membrana esterna mitocondriale per questa preparazione. Sono stati registrati flussi assoluti di ossigeno e solo un aumento del 6,3% è stato osservato nella respirazione, indicando una buona qualità della preparazione del tessuto.Il consumo di ossigeno e la produzione di ROS sono stati misurati simultaneamente in presenza di diversi substrati che forniscono carburante per il sistema di trasporto degli elettroni. L'aggiunta di piruvato e malato per il complesso mitocondriale I ha aumentato la respirazione. E l'ulteriore aggiunta di succinato per il complesso II aumenta anche il consumo di ossigeno.Pertanto altri substrati potrebbero essere testati. Anche la produzione di ROS è aumentata, indicando la perdita di ossigeno dal sistema di trasporto degli elettroni. L'aggiunta di adenosina difosfato nella concentrazione di saturazione ha aumentato il consumo di ossigeno guidando la formazione di ATP e diminuendo la produzione di ROS.Al contrario, l'oligotilazione ha ridotto il consumo di ossigeno e aumentato la produzione di ROS. Ciò ha suggerito che il nervo sciatico permeablizzato potrebbe replicare la relazione standard nella fisiologia mitocondriale. L'aggiunta di FCCP e retinone, allineati con i cambiamenti attesi del flusso di ossigeno, confermano che la fisiologia mitocondriale e il profilo bioenergetico sono stati preservati nel nervo sciatico permeablizzato.Il passo più importante è preparare delicatamente la sezione del tessuto, assicurarsi che tutte le aperture della camera siano adeguatamente pulite. Le alterazioni della funzione dei mitocondri potrebbero essere dovute a disfunzioni o a un numero mitocondriale inferiore. pertanto si raccomanda l'attività della sintasi citata e la conferma del contenuto di DNA mitocondriale mediante PCR.

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