Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry at JoVE.com

この研究は、Instituto Serrapilheira、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)の資金提供を受けた。アントニオ・ガリーナ・フィーリョ博士、モニカ・モンテロ・ロメリ博士、クラウディオ・増田博士の研究室施設への支援、マーサ・ソレンソン博士の論文改善のための親切で貴重なコメントに感謝しています。

現在のプロトコルは、研究における動物の使用に関する倫理委員会、CCS/UFRJ(CEUA-101/19)、および実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインによって承認されています。坐骨神経は生後4ヶ月の雄性C57BL/6マウスから単離され、施設ガイドラインに従って子宮頸部脱臼によって安楽死する。プロトコルのステップは、ミトコンドリアの劣化を避けるために最適化されています。?...

神経障害に伴ういくつかの疾患または状態は、危険因子としてミトコンドリア機能障害を有する。末梢神経のミトコンドリア機能の評価は、これらの神経変性状態でミトコンドリアがどのように作用するかを解明するために不可欠です。ミトコンドリア機能の評価は、単離方法の難しさおよび材料の不足のために面倒である。従って、ミトコンドリアの単離を必要としない組織透過技術の開?...

ミトコンドリアは、細胞の生存率を維持するために不可欠であり、エネルギー代謝(グルコース、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド代謝経路)などの多数の細胞機能を実行します。活性酸素種(ROS)産生の主要な部位として、ミトコンドリアはアポトーシスなどのいくつかの細胞シグナル伝達プロセスの中心であり、鉄硫黄(Fe-S)クラスターの合成、ミトコンドリアタンパク質の輸入と成熟、およびそれらのゲノムとリボソームの維持に関与しています1,2,3。ミトコンドリア膜ダイナミクスネットワークは、融合および核分裂プロセスによって制御され、彼らはまた、品質管理およびマイトファジー4,5,6のための機械を有する。
ミトコンドリア機能障害は、癌、糖尿病、および肥満などのいくつかの病理学的状態の出現と関連している7。ミトコンドリア機能の障害は、アルツハイマー病8,9、パーキンソン病10,11、筋萎縮性側索硬化症12,13、およびハンチントン病14,15のように、中枢神経系に影響を及ぼす神経変性障害において検出される。.末梢神経系において、軸索におけるミトコンドリア機能の喪失は、ギラン・バレー症候群16、17などの免疫神経障害において観察され、軸索における高いミトコンドリアROS産生と関連して、これらの事象はシュワン細胞18におけるMAPキナーゼ活性化をもたらす。これは、ミトコンドリア生理学が部位特異的細胞だけでなく、組織全体にとって不可欠である可能性があることを示しています。HIV関連遠位感覚多発ニューロパチー(HIV-DSP)において、ミトコンドリアは、転写のトランスアクチベーター(HIV-TAT)タンパク質がHIVを効率的に複製することを可能にするメカニズムにおける役割、ならびにHIV感染の病因における他のいくつかの役割を有する19,20。
坐骨神経ミトコンドリア生理学の評価は、神経障害を調査するための必須の標的として浮上している7、21、22。糖尿病性神経障害において、プロテオミクスおよびメタボローム解析は、糖尿病におけるほとんどの分子変化が坐骨神経ミトコンドリア酸化的リン酸化的リン酸化および脂質代謝に影響を及ぼすことを示唆している7。これらの変化はまた、肥満誘発性糖尿病の初期の徴候であるように思われる21。化学療法誘発性疼痛性神経障害のマウスモデルにおいて、坐骨神経におけるミトコンドリア障害は、酸化的リン酸化22の減少、およびミトコンドリア複合体活性、膜電位、およびATP含量の減少として検出される23。しかし、いくつかのグループが神経障害におけるミトコンドリア機能障害を挙げているが、これらの研究は、ミトコンドリア膜の保存のないミトコンドリア複合体における活性の測定に限定されており、ミトコンドリア完全性の評価またはミトコンドリアATP産生のパラメータとしてのATP含量の測定を欠いている。一般に、ミトコンドリアの酸素消費量とROS産生を適切に評価するには、パーコール/スクロース勾配での微分遠心分離によるミトコンドリアの単離が必要です。ミトコンドリアの単離はまた、大量の組織が必要であり、ミトコンドリアの喪失および破壊のために、坐骨神経組織の制限因子となり得る。
本研究は、ミトコンドリアの酸素消費と坐骨神経におけるROS産生としてミトコンドリア生理学を測定し、ミトコンドリア膜を保存し、ミトコンドリアを単離する必要なしに測定するプロトコルを提供することを目的とする。このプロトコルは、高分解能呼吸法(HRR)による透過処理筋線維24 における酸素消費測定値から適合される。この手順の利点は、坐骨神経などの少量の組織におけるミトコンドリアを評価し、その 場でミトコンドリアパラメータを評価し、それによってミトコンドリア環境、構造、および生体エネルギープロファイルを保存し、生理学的に信頼できる結果を得る可能性である。ミトコンドリアの呼吸状態は、ミトコンドリアの生体エネルギー学およびミトコンドリア膜完全性のためのシトクロムc係数を適切に評価するために、坐骨神経透過後の基質および阻害剤を用いて決定され、ミトコンドリア電子輸送系(ETS)の評価および必須パラメータの計算のステップのガイドを提供する。この研究は、末梢神経障害など、坐骨神経代謝が関与する病態生理学的メカニズムの質問に答えるためのツールを提供することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

末梢神経のミトコンドリア機能障害は、末梢神経障害に関連するいくつかの疾患を伴い、自己免疫疾患、糖尿病、感染症、遺伝性疾患、および腫瘍を含む複数の原因によって引き起こされる可能性がある。マウス末梢神経におけるミトコンドリア機能の評価は、サンプルサイズが小さいこと、組織内に存在するミトコンドリアの数が限られていること、およびミエリン鞘が存在するため、困難な場合があります。この研究で説明した技術は、ミトコンドリアを組織から単離する代わりに、筋線維に使用されるものから適応した独自の透過処理プロトコルを使用して、坐骨神経ミトコンドリア機能を評価することによって、これらの課題を最小限に抑えます。Amplex Red/Peroxidaseで蛍光反応種産生を測定し、サポニン透過神経における異なるミトコンドリア基質および阻害剤を比較することにより、ミトコンドリア呼吸状態、活性酸素種(ROS)、およびミトコンドリア複合体の活性を同時に検出することができました。したがって、ここで提示する方法は、他の技術によるミトコンドリア機能の評価と比較して利点を提供する。

透過処理された坐骨神経によるミトコンドリア酸素消費量を図2に表す。赤色のトレースは、単位質量あたりのO2フラックスをpmol/s.mgで表します。内因性基質(日常的な呼吸)で基礎酸素消費を記録した後、コハク酸塩(SUCC)を注入して複合体II(コハク酸デヒドロゲナーゼ)駆動呼吸を記録し、酸素消費率の増加をもたらす。順番に、飽和濃度のADPが添加され、ATP合成?...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

このプロトコルは、限られた数のミトコンドリアを含む小さな組織における困難な手順である単離されたミトコンドリアのパーセレーションによる神経内部のミトコンドリア機能の評価を可能にする。この技術は、保存されたミトコンドリアのin situにおいて、酸素消費やROS産生などのミトコンドリア機能を同時に解析する可能性を提供する。複数の基質、インヒビター、およびアンカプラ設計プロトコルを使用。いくつかの疾患は、ミトコンドリア機能、特に2型糖尿病または化学療法によって誘発される神経障害を共有する。これらの疾患では、ミトコンドリア酸化的リン酸化の障害が疾患の発症を決定する唯一の徴候である。この方法は、ミトコンドリア疾患メカニズムの調査、ミトコンドリアブースターまたは改善された神経因性疼痛などの治療法の探索により、神経生物学、生化学、および薬理学への洞察を提供する。まず、2.1ミリリットルのMRバッファーを各チャンバーにピペッティングして酸素センサーを校正します。ストッパーで閉じ、気泡が形成されるまでチャンバーに空気を吸い込みます。質量あたりの酸素流束が安定するまで、校正モードで37°Cで1時間攪拌します。HRRソフトウェアを使用して、製造元の指示に従って、ポラログラフィック酸素センサーの空気校正を実行します。組織調製のために、坐骨神経をそれを覆うのに十分なTP緩衝液を含むペトリ皿に入れる。鉗子で神経の一方の端を保持し、別のペアの鉗子で神経束を水平に引き抜きます。まず、表示された組織を、組織透過処理用の1ミリリットルのTPバッファーを含む小さな皿に移します。透過処理を開始するには、鉗子で組織を、1ミリリットルあたり50マイクログラムのサポニンを含む1ミリリットルのTPバッファーを含む別のディッシュに移します。プレートをマイクロプレートシェーカーに入れ、30分間穏やかにかき混ぜる。次いで、鉗子で組織を1ミリリットルのMR緩衝液を含む新鮮な皿に移し、10分間穏やかに撹拌させる。鉗子で組織を較正されたHRRチャンバーに移す。HRRチャンバを2.1ミリリットルのMRバッファーで満たします。Amplex Redおよびペルオキシダーゼを、それぞれ5マイクロモル、および1ミリリットルあたり2単位の最終濃度に加える。次に、透過性坐骨神経を追加します。機器の蛍光センサーを取り付けます。次に、ソフトウェアのコントロールセクションのライトをオフにし、ソフトウェアのオキシグラフに接続「プロトコルの編集に進む」をクリックし、組織重量を挿入します。レイアウトに移動し、単位サンプルあたりの特定のフラックスを選択します"オプション。次に、酸素消費量の読み出し、および必要に応じて過酸化水素の生産に同時にアクセスするプロットを選択します。約 10 分間待ちます。チャンバーの校正のために、過酸化水素の2つのパルスを、それぞれが260マイクロモルの最終濃度に注入する。ミトコンドリア複合体II基質であるコハク酸塩20マイクロリットルを注入し、ミトコンドリア電子伝達系を活性化する。ATP合成を活性化するために20マイクロリットルのADPを加える。順番に、膜完全性の指標として5マイクロリットルのシトクロムcを加える。酸素消費量のさらなる減少が観察されなくなるまで、オリゴマイシン1ミリリットルあたり0.2マイクログラムのアリコートで滴定する。酸素消費量のさらなる増加が観察されなくなるまで、ミトコンドリアアンカプラーであるFCCP当たり0.5マイクロモルのアリコートで滴定する。実験を終了するには、2マイクロリットルの抗マイシンAを注入し、5ミリモルの最終濃度を行い、流れが安定するのを待つ。コマンド バーに移動します。ソフトウェアで多感覚"を検索します。コントロールをクリックしてから、ファイルを保存を押して切断します。保存したファイルを開き、質量トレイあたりの酸素フラックスを選択して、実験酸素消費量の結果を取得します。注射とインジェクションの間のウィンドウを手動で選択するには、Shift キーとマウスの左ボタンを押します。マークに移動し、統計を選択して、基質、阻害剤、およびアンカプラプロトコルの各注入の結果を視覚化します。過酸化水素製造の場合、アンプスロープトレースで同様の手順を実行します。ATPシターゼ活性によって促進される膜電位の低下は、酸素消費を加速した。外因性シトクロムCの添加は、呼吸の最小限の刺激のみを促進し、この調製物のミトコンドリア外膜完全性を証明した。絶対酸素流が記録され、呼吸において6.3%の増加のみが観察され、組織調製物の良好な品質を示した。酸素消費量とROS生成を、電子輸送系に燃料を供給する異なる基質の存在下で同時に測定した。ミトコンドリア複合体に対するピルビン酸とリンゴ酸の添加は呼吸を増加させた。そして複合体IIに対するコハク酸塩のさらなる添加はまた、酸素消費を増加させる。したがって、他の基板を試験することができた。ROSの生成も増加し、電子輸送系からの酸素の漏れを示している。飽和濃度にアデノシン二リン酸を添加すると、酸素消費量が増加し、ATP形成が促進され、ROS産生が減少した。対照的に、オリゴ滴定は酸素消費量を減少させ、ROS産生を増加させた。これは、透過した坐骨神経がミトコンドリア生理学における標準的な関係を再現できることを示唆した。FCCPおよびレチノンの添加は、予想される酸素流束変化と整合し、ミトコンドリア生理学および生体エネルギープロファイルが透過した坐骨神経において保存されたことを確認する。最も重要なステップは、組織切片を穏やかに調製し、すべてのチャンバー開口部が適切に洗浄されていることを確認することです。ミトコンドリア機能の変化は、機能不全またはミトコンドリア数の低下に起因する可能性がある。従って引用された合成酵素活性およびミトコンドリアDNA含量確認はPCRによる推奨される。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

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クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

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200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

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