Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
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O estudo foi financiado pelo Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Agradecemos ao Dr. Antonio Galina Filho, à Dra.

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) e Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais experimentais. O nervo ciático é isolado de camundongos C57BL/6 machos de quatro meses de idade, eutanizados por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais. As etapas do protocolo são otimizadas para evitar a deterioração mitocondrial. Portanto, neste protocolo, a calibração dos sensores polarográficos de oxigênio foi ...

Várias doenças ou condições que acompanham neuropatias têm disfunção mitocondrial como fator de risco. A avaliação da função mitocondrial nos nervos periféricos é essencial para elucidar como as mitocôndrias agem nessas condições neurodegenerativas. A avaliação da função mitocondrial é trabalhosa devido à dificuldade do método de isolamento e à escassez de material. Assim, o desenvolvimento de técnicas de permeabilização tecidual que não requerem o isolamento das mitocôndrias é essencial.</p...

Mitocôndrias são essenciais para manter a viabilidade celular e desempenham inúmeras funções celulares, como metabolismo energético (glicose, aminoácido, lipídio e metabolismo de nucleotídeos). Como local principal da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), as mitocôndrias são centrais em diversos processos de sinalização celular, como apoptose e participam da síntese de aglomerados de ferro-enxofre (Fe-S), importação e maturação de proteínas mitocondriais, e manutenção de seu genoma e ribossomos 1,2,3. A rede de dinâmica da membrana mitocondrial é controlada por processos de fusão e fissão, e também possui máquinas para controle de qualidade e mitofagia 4,5,6.
A disfunção mitocondrial está associada ao aparecimento de várias condições patológicas, como câncer, diabetes e obesidade7. Distúrbios na função mitocondrial são detectados em distúrbios neurodegenerativos que afetam o sistema nervoso central, como na doença de Alzheimer 8,9, doença de Parkinson10,11, esclerose lateral amiotrófica12,13 e doença de Huntington14,15 . No sistema nervoso periférico, a perda da função mitocondrial em axônios é observada em neuropatias imunológicas, como a síndrome de Guillain-Barré16,17, e em associação com a alta produção de ROS mitocondrial em axônios, esses eventos levam à ativação do MAP Kinase em células schwann18. Isso demonstra que a fisiologia mitocondrial pode ser essencial não apenas para uma célula específica do local, mas para um tecido inteiro. Na polineuuropatia sensorial distal associada ao HIV (HIV-DSP), as mitocôndrias têm um papel no mecanismo pelo qual o trans-ativador da proteína de transcrição (HIV-TAT) permite que o HIV se replique eficientemente, bem como vários outros papéis na patogênese de infecção pelo HIV19,20.
A avaliação da fisiologia mitocondrial do nervo ciático emergiu como um alvo essencial para investigar a neuropatia 7,21,22. Na neuropatia diabética, análises proteômicas e metabolômicas sugerem que a maioria das alterações moleculares no diabetes afetam a fosforilação oxidativa do nervo ciático e o metabolismo lipídico7. Essas alterações também parecem ser sinais precoces de diabetes induzido pela obesidade21. Em um modelo de camundongos de neuropatia dolorosa induzida pela quimioterapia, o comprometimento mitocondrial no nervo ciático é detectado como uma diminuição na fosforilação oxidativa22, e uma redução das atividades de complexos mitocondriais, potencial de membrana e conteúdo ATP23. No entanto, embora vários grupos tenham citado disfunção mitocondrial em neuropatias, esses estudos estão limitados às medições de atividade em complexos mitocondriais sem preservação das membranas mitocondriais, sem avaliação da integridade mitocondrial ou medições de conteúdo ATP como parâmetro para a produção mitocondrial da ATP. Em geral, uma avaliação adequada do consumo mitocondrial de oxigênio e da produção de ROS requer o isolamento das mitocôndrias por centrifugação diferencial em um gradiente percoll/sacarose. O isolamento das mitocôndrias também pode ser um fator limitante para o tecido nervoso ciático devido à grande quantidade de tecido necessário e à perda e perturbação das mitocôndrias.
O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para medir a fisiologia mitocondrial como consumo mitocondrial de oxigênio e produção de ROS no nervo ciático, preservando membranas mitocondriais e sem a necessidade de isolar mitocôndrias. Este protocolo é adaptado a partir de medidas de consumo de oxigênio em fibras musculares permeabilizadas24 por respirometria de alta resolução (HRR). As vantagens desse procedimento são a possibilidade de avaliar mitocôndrias em pequenas quantidades de tecido, como o nervo ciático e avaliar parâmetros mitocondriais in situ, preservando assim o ambiente mitocondrial, estrutura e perfil bioenergésico, para obter um resultado fisiologicamente confiável. Os estados respiratórios mitocondriais foram determinados com substratos e inibidores após a permeabilização do nervo ciático para avaliar adequadamente o bioenergetics mitocondrial e o coeficiente c citocromo para a integridade da membrana mitocondrial, fornecendo um guia para etapas da avaliação do sistema de transporte eletrônico mitocondrial (ETS) e cálculo de parâmetros essenciais. Este estudo pode fornecer ferramentas para responder a perguntas em mecanismos fisiopatológicos nos quais o metabolismo do nervo ciático está implicado, como neuropatias periféricas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

A disfunção mitocondrial nos nervos periféricos acompanha várias doenças associadas à neuropatia periférica, que podem ser desencadeadas por múltiplas causas, incluindo doenças autoimunes, diabetes, infecções, doenças hereditárias e tumores. Avaliar a função mitocondrial nos nervos periféricos do camundongo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho da amostra, a um número limitado de mitocôndrias presentes no tecido e a presença de uma bainha de mielina. A técnica descrita neste trabalho minimiza esses desafios usando um protocolo único de permeabilização adaptado de um usado para fibras musculares, para avaliar a função mitocondrial do nervo ciático em vez de isolar as mitocôndrias do tecido. Medindo a produção fluormétrica de espécies reativas com Amplex Vermelho/Peroxidase e comparando diferentes substratos mitocondriais e inibidores em nervos de saponina-permeabilized, foi possível detectar estados respiratórios mitocondriais, espécies reativas de oxigênio (ROS) e a atividade de complexos mitocondriais simultaneamente. Portanto, o método aqui apresentado oferece vantagens em relação à avaliação da função mitocondrial por outras técnicas.

O consumo mitocondrial de oxigênio pelo nervo ciático permeabilizado está representado na Figura 2. O traço vermelho representa o fluxo O2 por unidade em pmol/s.mg. Após registrar um consumo basal de oxigênio com substratos endógenos (respiração de rotina), o succinato (SUCC) é injetado para registrar a respiração complexa II (succinato deshidrogenase), resultando em um aumento na taxa de consumo de oxigênio. Em sequência, adiciona-se uma concentração saturada de A...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Este protocolo permite a avaliação da função mitocondrial dentro do nervo por parcelamento das mitocôndrias isoladas, um procedimento desafiador em um pequeno tecido que contém um número limitado de mitocôndrias. A técnica oferece a possibilidade de analisar funções mitocôndrias como o consumo de oxigênio e a produção de ROS simultaneamente em uma mitocôndria preservada in situ. Com vários substratos, inibidores e protocolos de design desacopladores.Várias doenças compartilham a função mitocondrial, em particular neuropatias induzidas pelo diabetes tipo dois ou quimioterapia. Nessas doenças, os prejuízos da fosforilação oxidativa mitocondrial é o único sinal que dita o desenvolvimento da doença. Este método fornece insights sobre neurobiologia, bioquímica e farmacologia, com a investigação de mecanismos de doença mitocondrial, busca de terapias, como reforços mitocondriais ou dor neuropática amenizada.Para começar, calibrar os sensores de oxigênio tubondo 2,1 mililitros de amortecedor MR em cada câmara. Feche-a com as rolhas e desenhe ar para dentro da câmara até formar uma bolha. Mexa a 37 graus Celsius durante uma hora em modo de calibração até que o fluxo de oxigênio por massa se estabilize.O software HRR realiza uma calibração de ar dos sensores polarográficos de oxigênio de acordo com as instruções do fabricante. Para a preparação do tecido, coloque o nervo ciático em uma placa de Petri com tampão TP suficiente para cobri-lo. Segure uma extremidade do nervo com fórceps e com outro par de fórceps puxe os feixes nervosos horizontalmente.Primeiro, transfira o tecido exibido para um pequeno prato contendo um amortecedor TP mililitro para permeabilização tecidual. Para iniciar a permeabilização, transfira o tecido com fórceps para outro prato contendo um mililitro de tampão TP, contendo 50 microgramas por mililitro de saponina. Coloque a placa em um agitador de microplacos e deixe-a mexer suavemente por 30 minutos.Em seguida, transfira o tecido com fórceps para um prato fresco contendo um amortecedor MR mililitro, e deixe-o mexer suavemente por 10 minutos. Transfira o tecido com fórceps para uma câmara HRR calibrada. Encha as câmaras HRR com 2,1 mililitros de buffer MR.Adicione Amplex Vermelho e peroxidase a uma concentração final de cinco micromolar, e duas unidades por mililitro, respectivamente. Em seguida, adicione o nervo ciático permeável. Anexar os sensores fluorescentes do instrumento.Em seguida, desligue as luzes na seção de controle do software e clique em conectar-se ao oxígrafo"Vá editar protocolos" no software e insira o peso do tecido. Vá para o layout e escolha a opção de fluxo por unidade específica". Em seguida, selecione parcelas para acessar simultaneamente a leitura do consumo de oxigênio e, se necessário, a produção de peróxido de hidrogênio.Espere aproximadamente 10 minutos. Injete dois pulsos de peróxido de hidrogênio, cada um até uma concentração final de 260 micromolar para calibração da câmara. Injete 20 microliters de succinato, um substrato do complexo mitocondrial II, para ativar o sistema de transporte de elétrons mitocondrial.Adicione 20 microliters de ADP para ativar a síntese ATP. Em sequência, adicione cinco microlitadores de citocromo c como um indicador de integridade da membrana. Titrate com alíquotas de 0,2 microgramas por mililitro de oligomicina até que não seja observada mais diminuição no consumo de oxigênio.Titular com alíquotas de 0,5 micromoles por litro FCCP, o uncoupler mitocondrial, até que não seja observado mais aumento no consumo de oxigênio. Para terminar o experimento injete dois microliters de antimicina A, faça uma concentração final de cinco milimiliar e espere o fluxo estabilizar. Vá para a barra de comando.Procure por multissensorial"no software. Clique no controle", em seguida, pressione salvar arquivo" e desconecte. Abra o arquivo salvo e selecione o fluxo de oxigênio por bandejas em massa para obter os resultados experimentais de consumo de oxigênio.Selecione manualmente a janela entre as injeções pressionando o botão do mouse esquerdo mais o botão esquerdo do mouse. Vá para marcas e selecione estatísticas para visualizar os resultados de cada injeção de substratos, inibidores e protocolo de desacoplamento. Para produção de peróxido de hidrogênio, realize o mesmo procedimento com o traço de inclinação de amplificador.A diminuição do potencial de membrana promovida pela atividade de sythase atp acelerou o consumo de oxigênio. A adição de citocromo exógeno C promoveu apenas uma estimulação mínima da respiração, certificando a integridade da membrana externa mitocondrial para esta preparação. Foram registrados fluxos absolutos de oxigênio e observado apenas um aumento de 6,3% na respiração, indicando boa qualidade da preparação do tecido.O consumo de oxigênio e a produção de ROS foram medidos simultaneamente na presença de diferentes substratos que fornecem combustível para o sistema de transporte de elétrons. A adição de piruvato e malato para complexo mitocondrial eu aumentei a respiração. E a adição adicional de succinato para o complexo II também aumenta o consumo de oxigênio.Portanto, outros substratos poderiam ser testados. A produção de ROS também aumentou, indicando o vazamento de oxigênio do sistema de transporte de elétrons. A adição de difosfato de adenosina na concentração saturada aumentou o consumo de oxigênio impulsionando a formação de ATP e diminuindo a produção de ROS.Em contrapartida, a titulação do oligo diminuiu o consumo de oxigênio e aumentou a produção de ROS. Isso sugere que o nervo ciático do tamanho permeablado poderia replicar a relação padrão na fisiologia mitocondrial. A adição de FCCP e retinone, alinhada com as mudanças esperadas do fluxo de oxigênio, confirmam que a fisiologia mitocondrial e o perfil bioenergéstico foram preservados no nervo ciático do tamanho permeablístico.O passo mais importante é preparar suavemente a seção tecidual, garantir que todas as aberturas das câmaras sejam devidamente limpas. Alterações na função mitocôndria podem ser devido a disfunção ou um número mitocondrial mais baixo. portanto, recomenda-se a atividade de synthase e a confirmação do conteúdo de DNA mitocondrial pelo PCR.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

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Bioquímica

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

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Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

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High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

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Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

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Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

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Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

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Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

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