Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Это исследование финансировалось Институтом Серрапилхейры, Фондом организации ампаро в Пескисе по вопросам развития Рио-де-Жанейро (ФАПЕРЖ), Национальным советом по научным вопросам и технологиям (CNPq) и Координационным советом по вопросам образования в Нижнем Бразилии (CAPES). Мы благодарны д-ру Антонио Галине Фильо, д-ру Монике Монтеро Ломели и д-ру Клаудио Масуде за поддержку с лабораторным оборудованием, а также доктору Марте Соренсон за добрые и ценные комментарии по улучшению статьи.

Настоящий протокол одобрен Комитетом по этике использования животных в исследованиях, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) и руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию. Седалищный нерв изолирован от четырехмесячных самцов м?...

Некоторые заболевания или состояния, сопровождающие невропатии, имеют митохондриальную дисфункцию в качестве фактора риска. Оценка функции митохондрий в периферических нервах имеет важное значение для выяснения того, как митохондрии действуют в этих нейродегенеративных состояниях....

Митохондрии необходимы для поддержания жизнеспособности клеток и выполняют многочисленные клеточные функции, такие как энергетический метаболизм (пути метаболизма глюкозы, аминокислот, липидов и нуклеотидов). Как основной участок производства активных форм кислорода (АФК), митохондрии занимают центральное место в нескольких клеточных сигнальных процессах, таких как апоптоз, и участвуют в синтезе железо-серных (Fe-S) кластеров, импорте и созревании митохондриального белка и поддержании их генома и рибосом 1,2,3. Сеть динамики митохондриальных мембран контролируется процессами слияния и деления, а также имеет механизм контроля качества и митофагии 4,5,6.
Митохондриальная дисфункция связана с появлением нескольких патологических состояний, таких как рак, диабет и ожирение7. Нарушения митохондриальной функции выявляются при нейродегенеративных расстройствах, влияющих на центральную нервную систему, таких как болезнь Альцгеймера 8,9, болезнь Паркинсона10,11, боковой амиотрофический склероз12,13 и болезнь Хантингтона14,15 . В периферической нервной системе потеря митохондриальной функции в аксонах наблюдается при иммунных невропатиях, таких как синдром Гийена-Барре16,17, и в связи с высокой митохондриальной продукцией АФК в аксонах эти события приводят к активации MAP киназы в шванновских клетках18. Это демонстрирует, что митохондриальная физиология может быть необходима не только для клетки, специфичной для сайта, но и для всей ткани. При ВИЧ-ассоциированной дистальной сенсорной полинейропатии (ВИЧ-ДСП) митохондрии играют роль в механизме, с помощью которого трансактиватор транскрипционного белка (ВИЧ-ТАТ) позволяет ВИЧ эффективно реплицироваться, а также ряд других ролей в патогенезе ВИЧ-инфекции19,20.
Оценка физиологии митохондрий седалищного нерва стала важной целью для исследования нейропатии 7,21,22. При диабетической нейропатии протеомный и метаболомный анализы показывают, что большинство молекулярных изменений при диабете влияют на митохондриальное окислительное фосфорилирование седалищного нерва и липидный обмен7. Эти изменения также, по-видимому, являются ранними признаками диабета21, вызванного ожирением. В мышиной модели вызванной химиотерапией болезненной нейропатии митохондриальные нарушения в седалищном нерве обнаруживаются как снижение окислительного фосфорилирования22 и снижение активности митохондриальных комплексов, мембранного потенциала и содержания АТФ23. Однако, хотя несколько групп ссылались на митохондриальную дисфункцию при невропатиях, эти исследования ограничены измерениями активности в митохондриальных комплексах без сохранения митохондриальных мембран, без оценки целостности митохондрий или измерений содержания АТФ в качестве параметра для митохондриальной продукции АТФ. В целом, правильная оценка потребления митохондриального кислорода и производства АФК требует выделения митохондрий путем дифференциального центрифугирования в градиенте перколл/сахарозы. Выделение митохондрий также может быть ограничивающим фактором для ткани седалищного нерва из-за большого количества необходимой ткани и потери и разрушения митохондрий.
Настоящее исследование направлено на обеспечение протокола для измерения митохондриальной физиологии как потребления митохондриального кислорода и производства АФК в седалищном нерве, сохраняя митохондриальные мембраны и без необходимости выделения митохондрий. Этот протокол адаптирован из измерений потребления кислорода в пермеабилизированных мышечных волокнах24 с помощью респирометрии высокого разрешения (HRR). Преимуществами этой процедуры являются возможность оценки митохондрий в небольших количествах ткани, таких как седалищный нерв, и оценка митохондриальных параметров in situ, тем самым сохраняя митохондриальную среду, структуру и биоэнергетический профиль, для получения физиологически достоверного результата. Митохондриальные респираторные состояния определяли с помощью субстратов и ингибиторов после пермеабилизации седалищного нерва для правильной оценки митохондриальной биоэнергетики и коэффициента цитохрома C для целостности митохондриальной мембраны, обеспечивая руководство для этапов оценки митохондриальной электронной транспортной системы (ETS) и расчета существенных параметров. Это исследование может предоставить инструменты для ответа на вопросы в патофизиологических механизмах, в которых участвует метаболизм седалищного нерва, таких как периферические невропатии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

Митохондриальная дисфункция в периферических нервах сопровождает несколько заболеваний, связанных с периферической невропатией, которые могут быть вызваны несколькими причинами, включая аутоиммунные заболевания, диабет, инфекции, наследственные расстройства и опухоли. Оценка митохондриальной функции в периферических нервах мыши может быть сложной задачей из-за небольшого размера выборки, ограниченного количества митохондрий, присутствующих в ткани, и наличия миелиновой оболочки. Метод, описанный в этой работе, минимизирует эти проблемы, используя уникальный протокол пермеабилизации, адаптированный из того, который используется для мышечных волокон, для оценки митохондриальной функции седалищного нерва вместо выделения митохондрий из ткани. Измеряя продукцию флуориметрических реактивных видов с помощью Amplex Red/Peroxidase и сравнивая различные митохондриальные субстраты и ингибиторы в сапонин-пермеабилизированных нервах, можно было одновременно обнаружить митохондриальные респираторные состояния, активные формы кислорода (АФК) и активность митохондриальных комплексов. Таким образом, метод, представленный здесь, предлагает преимущества по сравнению с оценкой митохондриальной функции другими методами.

Потребление митохондриального кислорода пермеабилизированным седалищным нервом представлено на рисунке 2. Красный след представляет собой поток O2 на единицу массы в pmol/s.mg. После регистрации базального потребления кислорода эндогенными субстратами (рутинное ды?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Респирометрия высокого разрешения в сочетании с флуоресцентными датчиками определяет потребление митохондриального кислорода и генерацию активных форм кислорода (АФК). Настоящий протокол описывает метод оценки скорости дыхания митохондрий и продукции АФК в пермеабилизированном седалищном нерве.

Оценка митохондриальной функции в седалищном нерве с помощью респирометрии высокого разрешения

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Этот протокол позволяет оценить митохондриальную функцию внутри нерва путем парцелляции изолированных митохондрий, сложной процедуры в небольшой ткани, которая содержит ограниченное количество митохондрий. Метод обеспечивает возможность анализа функций митохондрий, таких как потребление кислорода и выработка АФК одновременно в сохраненных митохондриях in situ. С несколькими субстратами, ингибиторами и протоколами проектирования разъединителей.Некоторые заболевания имеют общую митохондриальную функцию, в частности невропатии, вызванные диабетом второго типа или химиотерапией. При этих заболеваниях нарушения митохондриального окислительного фосфорилирования являются единственным признаком, который диктует развитие болезни. Этот метод дает представление о нейробиологии, биохимии и фармакологии, с исследованием механизмов митохондриальных заболеваний, поиском методов лечения, таких как митохондриальные бустеры или улучшение невропатической боли.Для начала откалибруйте датчики кислорода, пипетировав 2,1 миллилитра буфера MR в каждую камеру. Закройте его пробками и втягивайте воздух в камеру, пока не образуется пузырь. Перемешивайте при 37 градусах Цельсия в течение одного часа в режиме калибровки до стабилизации потока кислорода на массу.С помощью программного обеспечения HRR выполните воздушную калибровку полярографических датчиков кислорода в соответствии с инструкциями производителя. Для приготовления ткани поместите седалищный нерв в чашку Петри с достаточным количеством буфера TP, чтобы покрыть его. Удерживайте один конец нерва щипцами и другой парой щипцов вытягивайте нервные пучки горизонтально.Во-первых, перенесите отображаемую ткань в небольшую посуду, содержащую один миллилитр TP буфера для пермеабилизации ткани. Чтобы начать пермеабилизацию, перенесите ткань щипцами в другую посуду, содержащую один миллилитр буфера ТП, содержащего 50 мкг на миллилитр сапонина. Поместите тарелку в микропластинчатый шейкер и дайте ей осторожно помешиваться в течение 30 минут.Затем переложите ткань щипцами в свежую посуду, содержащую один миллилитр МР-буфера, и дайте ей мягко помешиваться в течение 10 минут. Перенесите ткань щипцами в калиброванную камеру HRR. Заполните камеры HRR 2,1 миллилитра буфера MR.Добавьте Amplex Red и пероксидазу до конечной концентрации пяти микромоляров и двух единиц на миллилитр соответственно. Затем добавьте проницаемый седалищный нерв. Подключите флуоресцентные датчики прибора.Затем выключите свет в разделе управления программного обеспечения и нажмите на подключение к оксиграфу «Перейти к редактированию протоколов» в программном обеспечении и вставьте вес ткани. Перейдите к макету и выберите конкретный поток на единицу образца". Затем выберите участки для одновременного доступа к показаниям потребления кислорода и, при необходимости, к производству перекиси водорода.Подождите примерно 10 минут. Введите два импульса перекиси водорода, каждый до конечной концентрации 260 микромоляров для калибровки камеры. Введите 20 микролитров сукцината, субстрата митохондриального комплекса II, чтобы активировать митохондриальную систему переноса электронов.Добавьте 20 микролитров АДФ для активации синтеза АТФ. В последовательности добавляют пять микролитров цитохрома c в качестве индикатора целостности мембраны. Титруйте аликвотами по 0,2 мкг на миллилитр олигомицина до тех пор, пока дальнейшего снижения потребления кислорода не наблюдается.Титруйте с аликвотами 0,5 мкмоль на литр FCCP, митохондриального разъединителя, до тех пор, пока не наблюдается дальнейшего увеличения потребления кислорода. Чтобы закончить эксперимент, вводят два микролитра антимицина А, делают конечную концентрацию пяти миллимоляров и ждут, пока поток стабилизируется. Перейдите на панель команд.Поиск мультисенсорности» в программном обеспечении. Нажмите на элемент управления", затем нажмите сохранить файл" и отключитесь. Откройте сохраненный файл и выберите поток кислорода на лотки для массы, чтобы получить экспериментальные результаты потребления кислорода.Вручную выберите окно между инъекциями, нажав shift плюс левую кнопку мыши. Перейдите к отметкам и выберите статистику, чтобы визуализировать результаты для каждой инъекции субстратов, ингибиторов и протокола разъединителя. Для производства перекиси водорода выполняют ту же процедуру со следом наклона усилителя.Снижение мембранного потенциала, чему способствовала активность АТФ-ситазы, ускоряло потребление кислорода. Добавление экзогенного цитохрома С способствовало лишь минимальной стимуляции дыхания, сертифицируя целостность наружной мембраны митохондрий для этого препарата. Были зафиксированы абсолютные потоки кислорода и наблюдалось увеличение дыхания только на 6,3%, что свидетельствует о хорошем качестве тканевого препарата.Потребление кислорода и выработка АФК измерялись одновременно в присутствии различных подложек, обеспечивающих топливо для системы переноса электронов. Добавление пирувата и малата для митохондриального комплекса I усиливало дыхание. А дальнейшее добавление сукцината для комплекса II также увеличивает потребление кислорода.Поэтому могут быть протестированы и другие субстраты. Производство ROS также увеличилось, что указывает на утечку кислорода из электронной транспортной системы. Добавление аденозиндифосфата в насыщенную концентрацию увеличивало потребление кислорода, приводящее к образованию АТФ, и уменьшало выработку АФК.Напротив, титрование олиго уменьшило потребление кислорода и увеличило производство АФК. Это говорит о том, что пермеаблированный седалищный нерв может воспроизводить стандартное соотношение в митохондриальной физиологии. Добавление FCCP и ретинона, согласованное с ожидаемыми изменениями потока кислорода, подтверждает, что митохондриальная физиология и биоэнергетический профиль были сохранены в пермеаблированном седалищном нерве.Самым важным шагом является аккуратная подготовка среза ткани, обеспечение правильной очистки всех отверстий камеры. Изменения функции митохондрий могут быть вызваны дисфункцией или более низким митохондриальным числом. поэтому рекомендуется цитировать активность синтазы и подтверждение содержания митохондриальной ДНК с помощью ПЦР.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Измерение потребления кислорода печени митохондриальных и Протон утечки кинетики оценить митохондриальное дыхание в Гольштейн молочного скота

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Нейтронная спектроскопия высокого разрешения для исследования пикосекундно-наносекундной динамики белков и гидратационной воды

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Кислородно-независимые анализы для измерения функции митохондрий у млекопитающих

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...