Name: assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
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Este estudio fue financiado por el Instituto Serrapilheira, la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Agradecemos al Dr. Antonio Galina Filho, a la Dra. Mónica Montero Lomeli y al Dr. Claudio Masuda por el apoyo con las instalaciones del laboratorio, y a la Dra. Martha Sorenson por los amables y valiosos comentarios para mejorar el artículo.

El presente protocolo está aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales en la Investigación, CCS/UFRJ (CEUA-101/19), y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de experimentación. El nervio ciático se aísla de ratones machos C57BL/6 de cuatro meses de edad, sacrificados por luxación cervical según las pautas institucionales. Los pasos del protocolo están optimizados para evitar el deterioro mitocondrial. Por lo tanto, en este protocolo, la calibración ...

Varias enfermedades o afecciones que acompañan a las neuropatías tienen la disfunción mitocondrial como factor de riesgo. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos es esencial para dilucidar cómo actúan las mitocondrias en estas condiciones neurodegenerativas. La evaluación de la función mitocondrial es laboriosa debido a la dificultad del método de aislamiento y la escasez de material. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de permeabilización tisular que no requieran el aislamien...

Las mitocondrias son esenciales para mantener la viabilidad celular y realizan numerosas funciones celulares, como el metabolismo energético (vías de metabolismo de glucosa, aminoácidos, lípidos y nucleótidos). Como sitio principal de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), las mitocondrias son centrales en varios procesos de señalización celular como la apoptosis y participan en la síntesis de grupos de hierro-azufre (Fe-S), la importación y maduración de proteínas mitocondriales y el mantenimiento de su genoma y ribosomas 1,2,3. La red de dinámica de membranas mitocondriales está controlada por procesos de fusión y fisión, y también cuentan con maquinaria para el control de calidad y mitofagia 4,5,6.
La disfunción mitocondrial se asocia con la aparición de varias afecciones patológicas como el cáncer, la diabetes y la obesidad7. Se detectan alteraciones en la función mitocondrial en trastornos neurodegenerativos que afectan al sistema nervioso central, como en la enfermedad de Alzheimer 8,9, la enfermedad de Parkinson10,11, la esclerosis lateral amiotrófica12,13 y la enfermedad de Huntington 14,15 . En el sistema nervioso periférico, la pérdida de la función mitocondrial en los axones se observa en neuropatías inmunes, como el síndrome de Guillain-Barré16,17, y en asociación con una alta producción de ROS mitocondriales en axones, estos eventos conducen a la activación de la MAP quinasa en las células de Schwann18. Esto demuestra que la fisiología mitocondrial puede ser esencial no solo para una célula específica del sitio, sino para un tejido completo. En la polineuropatía sensorial distal asociada al VIH (HIV-DSP), las mitocondrias tienen un papel en el mecanismo por el cual la proteína transactivadora de la transcripción (HIV-TAT) permite que el VIH se replique de manera eficiente, así como varias otras funciones en la patogénesis de la infección por VIH19,20.
La evaluación de la fisiología mitocondrial del nervio ciático se ha convertido en un objetivo esencial para la investigación de la neuropatía 7,21,22. En la neuropatía diabética, los análisis proteómicos y metabolómicos sugieren que la mayoría de las alteraciones moleculares en la diabetes afectan a la fosforilación oxidativa mitocondrial del nervio ciático y al metabolismo lipídico7. Estas alteraciones también parecen ser signos tempranos de diabetes inducida por la obesidad21. En un modelo de ratón de neuropatía dolorosa inducida por quimioterapia, el deterioro mitocondrial en el nervio ciático se detecta como una disminución en la fosforilación oxidativa22 y una reducción de las actividades de los complejos mitocondriales, el potencial de membrana y el contenido de ATP23. Sin embargo, aunque varios grupos han citado la disfunción mitocondrial en neuropatías, estos estudios se limitan a las mediciones de la actividad en complejos mitocondriales sin preservación de las membranas mitocondriales, careciendo de evaluación de la integridad mitocondrial o mediciones del contenido de ATP como parámetro para la producción de ATP mitocondrial. En general, una evaluación adecuada del consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS requiere el aislamiento de las mitocondrias por centrifugación diferencial en un gradiente percol/sacarosa. El aislamiento de las mitocondrias también puede ser un factor limitante para el tejido nervioso ciático debido a la gran cantidad de tejido necesario y la pérdida e interrupción de las mitocondrias.
El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para medir la fisiología mitocondrial como el consumo de oxígeno mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático, preservando las membranas mitocondriales y sin necesidad de aislar las mitocondrias. Este protocolo se adapta a partir de mediciones de consumo de oxígeno en fibras musculares permeabilizadas24 mediante respirometría de alta resolución (HRR). Las ventajas de este procedimiento son la posibilidad de evaluar las mitocondrias en pequeñas cantidades de tejido como el nervio ciático y evaluar los parámetros mitocondriales in situ, preservando así el entorno mitocondrial, la estructura y el perfil bioenergético, para obtener un resultado fisiológicamente confiable. Los estados respiratorios mitocondriales se determinaron con sustratos e inhibidores después de la permeabilización del nervio ciático para evaluar adecuadamente la bioenergética mitocondrial y el coeficiente del citocromo c para la integridad de la membrana mitocondrial, proporcionando una guía para los pasos de la evaluación del sistema de transporte de electrones mitocondrial (ETS) y el cálculo de los parámetros esenciales. Este estudio puede proporcionar herramientas para responder preguntas sobre mecanismos fisiopatológicos en los que está implicado el metabolismo del nervio ciático, como las neuropatías periféricas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39; triphosphate dissodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A (from Streptomyces sp.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>(from equine heart; small hemeprotein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataLab version 5.1.1.91</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital orbital microplate shaker 120V</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>88882005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HAM80075</td>
			<td>10 uL, 25 uL and 50 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30% W/W</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, curved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting forceps, straight</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Filter set Amplex Red</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44321-01</td>
			<td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>44210-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4876</td>
			<td>(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OROBOROS Oxygraph-2k</td>
			<td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td>
			<td>http://www.oroboros.at</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase from horseradish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAE0073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mitochondrial function in sciatic nerve by high-resolution respirometry

La disfunción mitocondrial en los nervios periféricos acompaña a varias enfermedades asociadas con la neuropatía periférica, que puede desencadenarse por múltiples causas, incluidas enfermedades autoinmunes, diabetes, infecciones, trastornos hereditarios y tumores. La evaluación de la función mitocondrial en los nervios periféricos del ratón puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de la muestra, un número limitado de mitocondrias presentes en el tejido y la presencia de una vaina de mielina. La técnica descrita en este trabajo minimiza estos desafíos mediante el uso de un protocolo de permeabilización único adaptado de uno utilizado para las fibras musculares, para evaluar la función mitocondrial del nervio ciático en lugar de aislar las mitocondrias del tejido. Al medir la producción fluorimétrica de especies reactivas con Amplex Red/Peroxidasa y comparar diferentes sustratos e inhibidores mitocondriales en nervios permeabilizados con saponina, fue posible detectar estados respiratorios mitocondriales, especies reactivas de oxígeno (ROS) y la actividad de complejos mitocondriales simultáneamente. Por lo tanto, el método presentado aquí ofrece ventajas en comparación con la evaluación de la función mitocondrial mediante otras técnicas.

El consumo de oxígeno mitocondrial por el nervio ciático permeabilizado está representado en la Figura 2. La traza roja representa el flujo de O2 por unidad de masa en pmol/s.mg. Después de registrar un consumo basal de oxígeno con sustratos endógenos (respiración de rutina), se inyecta succinato (SUCC) para registrar la respiración impulsada por el complejo II (succinato deshidrogenasa), lo que resulta en un aumento en la tasa de consumo de oxígeno. En secuencia, se agre...

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Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Este protocolo permite la evaluación de la función mitocondrial dentro del nervio mediante la parcelación de las mitocondrias aisladas, un procedimiento desafiante en un tejido pequeño que contiene un número limitado de mitocondrias. La técnica ofrece la posibilidad de analizar las funciones de las mitocondrias, como el consumo de oxígeno y la producción de ROS, simultáneamente en una mitocondria preservada in situ. Con múltiples sustratos, inhibidores y protocolos de diseño de desacopladores.Varias enfermedades comparten la función mitocondrial, en particular las neuropatías inducidas por la diabetes tipo dos o la quimioterapia. En estas enfermedades, las alteraciones de la fosforilación oxidativa mitocondrial es el único signo que dicta el desarrollo de la enfermedad. Este método proporciona información sobre neurobiología, bioquímica y farmacología, con la investigación de los mecanismos de la enfermedad mitocondrial, la búsqueda de terapias, como los refuerzos mitocondriales o el dolor neuropático mejorado.Para comenzar, calibre los sensores de oxígeno canalizando 2,1 mililitros de tampón de RM en cada cámara. Ciérrelo con los tapones y extraiga aire hacia la cámara hasta que se forme una burbuja. Revuelva a 37 grados Celsius durante una hora en modo de calibración hasta que el flujo de oxígeno por masa se estabilice.Utilizando el software HRR realice una calibración de aire de los sensores polarográficos de oxígeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la preparación del tejido, coloque el nervio ciático en una placa de Petri con suficiente tampón TP para cubrirlo. Sostenga un extremo del nervio con fórceps y con otro par de fórceps saque los haces nerviosos horizontalmente.Primero, transfiera el tejido mostrado a un plato pequeño que contenga un tampón TP de mililitro para la permeabilización del tejido. Para iniciar la permeabilización, transfiera el tejido con fórceps a otro plato que contenga un mililitro de tampón TP, que contenga 50 microgramos por mililitro de saponina. Coloque la placa en un agitador de microplacas y déjela remover suavemente durante 30 minutos.Luego, transfiera el tejido con fórceps a un plato fresco que contenga un tampón de RM de mililitros y déjelo remover suavemente durante 10 minutos. Transfiera el tejido con fórceps a una cámara HRR calibrada. Llene las cámaras HRR con 2,1 mililitros de tampón MR.Agregue Amplex Red y peroxidasa a una concentración final de cinco micromolares y dos unidades por mililitro, respectivamente. Luego, agregue el nervio ciático permeable. Conecte los sensores fluorescentes del instrumento.Luego, apague las luces en la sección de control del software y haga clic en conectar al oxígrafo"Ir a editar protocolos" en el software e inserte el peso del tejido. Vaya a diseño y elija la opción de flujo específico por unidad de muestra. Luego seleccione parcelas para acceder simultáneamente a la lectura del consumo de oxígeno y, si es necesario, a la producción de peróxido de hidrógeno.Espere aproximadamente 10 minutos. Inyectar dos pulsos de peróxido de hidrógeno, cada uno a una concentración final de 260 micromolares para la calibración de la cámara. Inyectar 20 microlitros de succinato, un sustrato del complejo mitocondrial II, para activar el sistema de transporte de electrones mitocondrial.Agregue 20 microlitros de ADP para activar la síntesis de ATP. En secuencia, agregue cinco microlitros de citocromo c como indicador de la integridad de la membrana. Valorar con alícuotas de 0,2 microgramos por mililitro de oligomicina hasta que no se observe una mayor disminución en el consumo de oxígeno.Titula con alícuotas de 0,5 micromoles por litro FCCP, el desacoplador mitocondrial, hasta que no se observe un mayor aumento en el consumo de oxígeno. Para finalizar el experimento inyectar dos microlitros de antimicina A, hacer una concentración final de cinco milimolares y esperar a que el flujo se estabilice. Vaya a la barra de comandos.Búsqueda de multisensorial" en el software. Haga clic en control"luego presione guardar archivo" y desconéctese. Abra el archivo guardado y seleccione el flujo de oxígeno por bandejas de masa para obtener los resultados experimentales de consumo de oxígeno.Seleccione manualmente la ventana entre inyecciones presionando el botón shift plus left mouse. Vaya a marcas y seleccione estadísticas para visualizar los resultados de cada inyección de sustratos, inhibidores y protocolo de desacoplador. Para la producción de peróxido de hidrógeno realizar el mismo procedimiento con la traza de pendiente del amplificador.La disminución del potencial de membrana promovida por la actividad de la ATP sitasa aceleró el consumo de oxígeno. La adición de citocromo C exógeno promovió solo una estimulación mínima de la respiración, certificando la integridad de la membrana externa mitocondrial para esta preparación. Se registraron flujos absolutos de oxígeno y solo se observó un aumento del 6,3% en la respiración, lo que indica una buena calidad de la preparación del tejido.El consumo de oxígeno y la producción de ROS se midieron simultáneamente en presencia de diferentes sustratos que proporcionan combustible para el sistema de transporte de electrones. La adición de piruvato y malato para el complejo mitocondrial I aumentó la respiración. Y la adición adicional de succinato para el complejo II también aumenta el consumo de oxígeno.Por lo tanto, se podrían probar otros sustratos. La producción de ROS también aumentó, lo que indica la fuga de oxígeno del sistema de transporte de electrones. La adición de difosfato de adenosina en la concentración saturante aumentó el consumo de oxígeno impulsando la formación de ATP y disminuyendo la producción de ROS.Por el contrario, la titulación de oligo disminuyó el consumo de oxígeno y aumentó la producción de ROS. Esto sugirió que el nervio ciático permeablizado podría replicar la relación estándar en la fisiología mitocondrial. La adición de FCCP y retinona, alineados con los cambios esperados en el flujo de oxígeno, confirman que la fisiología mitocondrial y el perfil bioenergético se conservaron en el nervio ciático permeablizado.El paso más importante es preparar suavemente la sección de tejido, asegurarse de que todas las aberturas de la cámara se limpien adecuadamente. Las alteraciones en la función mitocondrial podrían deberse a una disfunción o a un menor número mitocondrial. por lo tanto, se recomienda la actividad de la sintasa citada y la confirmación del contenido de ADN mitocondrial por PCR.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

Bioquímica

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