Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Romas Geleziunas og Jeff Murry og folkene hos Gilead for at levere de antiretrovirale lægemidler, der anvendes i denne undersøgelse. Dette arbejde blev finansieret af NCI 1R01CA239261-01 (til køkken), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core og Humanized Mouse Core), U19AI149504 (: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (til Zhen), NIAID R2120200174 (: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Dette arbejde blev også støttet af UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust og McCarthy Family Foundation.

Anonymiseret humant føtalvæv blev erhvervet kommercielt. Dyreforsøg blev udført i henhold til protokoller godkendt af University of California, Los Angeles og (UCLA) Animal Research Committee (ARC) i overensstemmelse med alle føderale, statslige og lokale retningslinjer. Specifikt blev alle forsøgene udført i overensstemmelse med anbefalinger og retningslinjer for opstaldning og pleje af forsøgsdyr fra National Institutes of Health (NIH) og Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Car...

En oral cART-administrationsmetode er udviklet her til HIV-1-inficerede humaniserede mus ved at kombinere tre antiretrovirale lægemidler inden for mad med højt næringsindhold. Sammenlignet med administration ved daglige injektioner er oral levering lettere at bruge, begrænser administrationsfrekvensen, reducerer dyrehåndtering, minimerer stress og forbedrer sikkerheden55. Indtil dette tidspunkt har kun få undersøgelser i humaniserede mus 24,37,41 brugt madpiller indeholdende knuste ART-læg...

Den forventede levetid for kronisk human immundefektvirus (HIV)-inficerede personer er signifikant forbedret med kombinationsbaseret antiretroviral behandling (cART)1,2. cART reducerer med succes HIV-1-replikationen og øger CD4 + T-celletal til normalitet hos størstedelen af HIV-1 kronisk inficerede deltagere3, hvilket resulterer i forbedret generel sundhed og dramatisk reduceret sygdomsprogression4. Imidlertid etableres det latente HIV-1-reservoir, selv når ART initieres under akut infektion 5,6,7. Reservoirer fortsætter over år under ART, og hurtig viral rebound efter ART-afbrydelse er veldokumenteret 8,9. Mennesker, der lever med hiv på ART, er også udsat for en højere risiko for comorbiditeter som hjerte-kar-sygdomme, kræft og neuroforstyrrelser10,11,12. Derfor er der brug for en funktionel kur mod hiv. Dyremodeller for HIV-1-infektion giver åbenlyse fordele ved at udvikle og validere nye HIV-kurstrategier13,14,15. Humaniserede mus, som en lille dyremodel, kan give multilineage human immuncellerekonstitution i forskellige væv, hvilket giver mulighed for tæt undersøgelse af HIV-infektion16,17,18,19. Blandt humaniserede modeller rekapitulerer den humaniserede knoglemarv-lever-thymus (BLT) -model med succes kronisk HIV-1-infektion samt funktionelle humane immunresponser på HIV-1-infektion 20,21,22,23,24. Derfor er den humaniserede BLT-musemodel blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge forskellige aspekter inden for HIV-forskningsområdet. Humaniserede BLT-mus er ikke kun veletablerede modeller til rekapitulering af vedvarende HIV-1-infektion og patogenese, men også følgeværktøjer til evaluering af celleterapibaserede interventionsstrategier. De nuværende forfattere og andre har vist, at den humaniserede BLT-musemodel rekapitulerer vedvarende HIV-1-infektion og patogenese 25,26,27 og giver værktøjer til at evaluere celleterapibaserede interventionsstrategier 28,29,30,31,32,33. 
cART-regimer bestående af kombinationer af antiretrovirale lægemidler, der tages dagligt, undertrykker HIV-1-replikation til det punkt, at den virale belastning hos succesfuldt behandlede individer forbliver uopdagelig på lang sigt34. Resultaterne af behandling af HIV-inficerede humaniserede mus med klinisk relevante cART-regimer ligner dem, der observeres hos HIV-1-inficerede ART-behandlede individer22: HIV-1-niveauer undertrykkes under grænserne for påvisning og afbrydelse af cART resulterer i en rebound af HIV-replikation fra det latente reservoir35. Subkutan (SC)27,36,37 eller intraperitoneal (IP)37,38,39 injektion er den vej, der almindeligvis anvendes til cART-behandling hos humaniserede mus. Imidlertid fremkalder intensiv daglig injektion stress på dyr ved fysisk fastholdelse40. Det er også arbejdskrævende og potentielt usikkert for forskere på grund af øget eksponering for hiv, mens de bruger skarpe. Oral administration er ideel til at efterligne absorption, distribution og udskillelse af cART-lægemidler, der tages af HIV-1-inficerede individer. Oral administration involverer typisk tilpassede og ofte besværlige procedurer for at sætte de antiretrovirale lægemidler i steriliseret (nødvendigt på grund af musenes immundefekt) mad 24,37,41 eller vand 42,43,44,45,46 , som måske eller måske ikke er kemisk kompatibel med mange antiretrovirale lægemidler eller resulterer i noget, musene ikke let ville spise eller drikke (hvilket ville påvirke dosis- og lægemiddelniveauer i kroppen). Den nye peroral cART-administrationsmetode, der foreslås her, overgår tidligere leveringsforsøg på grund af dens kompatibilitet med forskellige typer antiretrovirale lægemidler, sikkerhed og nem forberedelse og administration og reduktion af dyrestress og angst som følge af den daglige injektion.
Tenofovirdisoproxilfumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) og Raltegravir (RAL) er dårligt vandopløselige lægemidler. Interessant nok observeres øget biotilgængelighed af TDF med fedtholdige fødevarer, hvilket tyder på, at konkurrencedygtig hæmning af lipaser af fed mad kan give en vis beskyttelse for TDF47. Derfor blev DietGel Boost-kopper valgt til at erstatte almindelig gnaverchow som leveringsmetode baseret på deres beskedne fedtindhold (20,3 g pr. 100 g) sammenlignet med almindelig gnaverchow (10 g pr. 100 g) og en typisk fedtholdig musediæt (40-60 g pr. 100 g)48. Den samlede vægt af en kop er 75 g; Således vil hver kop indeholde mængden af mad og derfor lægemiddel, der er tilstrækkelig til fem mus over 3 dage.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

Pandemien med human immundefektvirus (HIV-1) fortsætter med at sprede sig med uformindsket styrke over hele verden, og i øjeblikket er der ingen vaccine tilgængelig mod hiv. Selvom kombinationsmæssig antiretroviral terapi (cART) har haft succes med at undertrykke viral replikation, kan den ikke fuldstændigt udrydde reservoiret fra HIV-inficerede individer. En sikker og effektiv kurstrategi mod hiv-infektion vil kræve flerstrengede metoder, og derfor er udviklingen af dyremodeller for HIV-1-infektion afgørende for udviklingen af hiv-kurforskning. Humaniserede mus rekapitulerer nøglefunktioner ved HIV-1-infektion. Den humaniserede musemodel kan inficeres af HIV-1, og viral replikation kan kontrolleres med cART-regimer. Desuden resulterer cART-afbrydelse i en hurtig viral rebound i humaniserede mus. Administration af cART til dyret kan imidlertid være ineffektiv, vanskelig eller giftig, og mange klinisk relevante cART-regimer kan ikke udnyttes optimalt. Sammen med at være potentielt usikker for forskere, indgiver administration af cART ved en almindeligt anvendt intensiv daglig injektionsprocedure stress ved fysisk fastholdelse af dyret. Den nye orale cART-metode til behandling af HIV-1-inficerede humaniserede mus beskrevet i denne artikel resulterede i undertrykkelse af viræmi under detektionsniveauet, øget hastighed af CD4 + restaurering og forbedret generel sundhed hos HIV-1-inficerede humaniserede mus.

Hvis man antager, at en gennemsnitlig mus, der vejer 25 g, indtager 4 g mad om dagen, svarer den daglige lægemiddeldosis gennem oral indtagelse til 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC og 768 mg/kg RAL. For at teste, om det optimerede fødevareregime er giftigt og påvirker det generelle helbred sammenlignet med daglig injektion af cART, blev musenes vægt overvåget ugentligt før og under cART gennem oral eller subkutan injektion. Der var ingen signifikante vægtforskelle før cART-administration i hver gruppe (<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Denne protokol beskriver en ny metode til at levere orale kombinationsmæssige antiretrovirale lægemidler, der med succes undertrykker HIV-1 RNA-replikation i humaniserede mus.

Oral kombinationsmæssig antiretroviral behandling i HIV-1-inficerede humaniserede mus

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Denne protokol beskriver en ny metode til at levere orale kombination antiretrovirale lægemidler eller ART, der med succes undertrykker HIV RNA-replikation i humaniserede mus. Den nye orale ART-metode overgår tidligere leveringsforsøg på grund af dens sikkerhed, lette forberedelse og administration og reduceret dyrestress som følge af en daglig injektion. Den foreslåede orale leveringsmetode til at undertrykke HIV RNA-replikation i humaniserede mus vil være meget værdifuld for prækliniske proof-of-concept-undersøgelser for at udvikle nye kurbehandlinger, der nøje efterligner lægemiddelafgivelsen hos kroniske HIV-inficerede individer.Valerie Rezak, en laboratorieleder og tekniker fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren. Begynd med at veje individuelle lægemidler. Lav 10 madkopper med cART ved hjælp af sterile celleskrabere til at veje 250 milligram FTC, 375 milligram TDF og 500 milligram RAL eller ELV i individuelle, sterile 50 milliliter centrifugerør i et biosikkerhedsskab.Tilføj DMSO til FTC- og TDF-røret for at udgøre en endelig koncentration på 250 milligram pr. milliliter og ind i RAL- eller ELV-røret til en endelig koncentration på 500 milligram pr. Milliliter. Bland lægemiddelopløsningen under omrøring og pipettering, indtil der opnås en klar opløsning. Steriliser opløsningerne ved hjælp af et 0,22 mikrometer hydrofilt PVDF-membranfilter med en steril sprøjte.Individuelle lægemiddelopløsninger kan opbevares ved minus 20 grader Celsius i 12 uger. Optøning af en aliquot af hver lægemiddelopløsning før brug ved 37 grader Celsius, indtil opløsningen bliver klar. Bland godt ved hjælp af en pipette.Kombiner lægemidlerne opløst i DMSO og bland godt for at udgøre en masterblanding indeholdende en milliliter FTC, 1,5 ml TDF og en milliliter ELV eller RAL. Tilsæt 350 mikroliter cART master mix-opløsning i en kop for at forberede en diætgel boost cART-kop. Tilsæt 0,75 ml trimethoprim sulfamethoxasole i koppen.Rør grundigt med en milliliter sterile pipettespidser. Ved hjælp af en pipettespids aliquot madkoppen indeholdende cART på en 60 millimeter petriskål. Beregn mængden af cART i madkoppen ved at veje maden til hvert bur i henhold til antallet af mus.Fjern almindelig chow fra buret og udskift den med en madkop, der indeholder cART. Opdater cART mad tre gange om ugen. Vej brugte kopper for at overvåge indtag.Vej derefter musene ugentligt for at bekræfte forbruget. Efter fire ugers HIV-1-infektion blev mus behandlet i yderligere 7,5 uger, enten med FTC/TDF/RAL-regimet gennem subkutan injektion eller ved oral administration af FTC/TDF/RAL eller FTC/TDF/ELV. Musens vægt faldt konstant under daglig cART subkutan injektion.I modsætning hertil genoprettede diætgel musevægte til præ-ART-initieringsniveauer efter fem ugers oral cART-administration. Derudover blev der ikke observeret signifikante vægtændringer mellem RAL- eller ELV-grupper. Inden for fire uger undertrykte FTC / TDF / ELV og RAL / ART-fødevareregimen den virale replikation med henholdsvis 100% og 80%.70 % af de mus, der fik SC-injektion, nåede uopdagelige niveauer efter fire ugers behandling. Resultaterne bekræftede, at oral administration undertrykte viral replikation hurtigere og mere effektivt end subkutane injektioner. Desuden forhindrede cART-fødevareregimet det yderligere fald i CD4 til CD8-forholdet i det perifere blod tidligere end daglige injektioner.Det er afgørende at opretholde steriliteten af ethvert materiale, der er involveret i protokollen under hele processen, og undgå flere frysninger og optøning af cART-lageropløsningen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating af HIV-1 kerner

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Scanning af HIV-1 Envelope-induceret Virologisk Synapse og signaler på syntetiske lipiddobbeltlagenes

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nye værktøjer til at udvide regulatoriske T celler fra HIV-1-inficerede personer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationel Evaluering af HIV-1 trimere kappeglycoproteinerne hjælp af en celle-ELISA-assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering af Exosomer fra plasma af HIV-1 Positive Personer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...