Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

We willen Drs. Romas Geleziunas en Jeff Murry en de mensen van Gilead bedanken voor het verstrekken van de antiretrovirale geneesmiddelen die in deze studie worden gebruikt. Dit werk werd gefinancierd door NCI 1R01CA239261-01 (to Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (de UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core en Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PI's: Kitchen &Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (naar Zhen), NIAID R2120200174 (PI's: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Dit werk werd ook ondersteund door het UCLA AIDS Institute, de James B. Pendleton Charitable Trust en de McCarthy Family Foundation.

Geanonimiseerd menselijk foetaal weefsel werd commercieel verkregen. Dieronderzoek werd uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Universiteit van Californië, Los Angeles en (UCLA) Animal Research Committee (ARC) in overeenstemming met alle federale, staats- en lokale richtlijnen. In het bijzonder werden alle experimenten uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen en richtlijnen voor huisvesting en verzorging van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH) en de Association for the A...

Een orale cART-toedieningsmethode wordt hier ontwikkeld voor HIV-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen door drie antiretrovirale geneesmiddelen te combineren in voedsel met een hoog voedingsgehalte. In vergelijking met toediening door dagelijkse injecties is orale toediening gemakkelijker te gebruiken, beperkt de toedieningsfrequentie, vermindert de behandeling van dieren, minimaliseert stress en verbetert de veiligheid55. Tot nu toe hebben slechts een paar studies bij gehumaniseerde muizen<sup c...

De levensverwachting van personen die met chronisch humaan immunodeficiëntievirus (HIV) zijn geïnfecteerd, is aanzienlijk verbeterd met combinatie antiretrovirale behandeling (cART)1,2. cART vermindert met succes de HIV-1-replicatie en verhoogt het aantal CD4 + T-cellen tot normaliteit bij de meerderheid van hiv-1 chronisch geïnfecteerde deelnemers3, wat resulteert in een verbeterde algehele gezondheid en dramatisch verminderde ziekteprogressie4. Het latente HIV-1-reservoir wordt echter zelfs vastgesteld wanneer ART wordt geïnitieerd tijdens acute infectie 5,6,7. Reservoirs blijven jarenlang bestaan tijdens ART en snelle virale rebound na ART-onderbreking is goed gedocumenteerd 8,9. Mensen met hiv op ART zijn ook vatbaar voor een hoger risico op comorbiditeiten zoals hart- en vaatziekten, kanker en neurostoornissen 10,11,12. Daarom is een functionele remedie voor HIV nodig. Diermodellen voor HIV-1-infectie bieden duidelijke voordelen bij het ontwikkelen en valideren van nieuwe HIV-genezingsstrategieën 13,14,15. Gehumaniseerde muizen, als een klein diermodel, kunnen multilineage menselijke immuuncelreconstitutie in verschillende weefsels bieden, wat de nauwkeurige studie van HIV-infectie mogelijk maakt 16,17,18,19. Onder gehumaniseerde modellen recapituleert het gehumaniseerde beenmerg-lever-thymus (BLT) -model met succes chronische HIV-1-infectie en functionele menselijke immuunresponsen op HIV-1-infectie 20,21,22,23,24. Daarom is het gehumaniseerde BLT-muismodel op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten op het gebied van HIV-onderzoek te onderzoeken. Gehumaniseerde BLT-muizen zijn niet alleen gevestigde modellen voor de recapitulatie van persistente HIV-1-infectie en pathogenese, maar ook consequente hulpmiddelen voor de evaluatie van op celtherapie gebaseerde interventiestrategieën. De huidige auteurs en anderen hebben aangetoond dat het gehumaniseerde BLT-muizenmodel persistente HIV-1-infectie en pathogenese 25,26,27 samenvat en hulpmiddelen biedt om op celtherapie gebaseerde interventiestrategieën te evalueren 28,29,30,31,32,33.
cART-regimes bestaande uit combinaties van antiretrovirale geneesmiddelen die dagelijks worden ingenomen, onderdrukken hiv-1-replicatie tot het punt dat de virale lading bij succesvol behandelde personen op lange termijn niet detecteerbaar blijft34. De resultaten van de behandeling van hiv-geïnfecteerde gehumaniseerde muizen met klinisch relevante cART-regimes lijken op die waargenomen bij hiv-1 geïnfecteerde art-behandelde personen22: HIV-1-niveaus worden onderdrukt onder de detectiegrenzen en onderbreking van cART resulteert in een rebound van HIV-replicatie uit het latente reservoir35. Subcutane (SC)27,36,37 of intraperitoneale (IP)37,38,39 injectie is de route die vaak wordt gebruikt voor cART-behandeling bij gehumaniseerde muizen. Intensieve dagelijkse injectie veroorzaakt echter stress bij dieren door fysieke terughoudendheid40. Het is ook arbeidsintensief en potentieel onveilig voor onderzoekers vanwege verhoogde blootstelling aan HIV tijdens het gebruik van scherpe voorwerpen. Orale toediening is ideaal om de absorptie, distributie en uitscheiding na te bootsen van cART-geneesmiddelen die worden ingenomen door HIV-1-geïnfecteerde personen. Orale toediening omvat meestal aangepaste en vaak moeizame procedures om de antiretrovirale geneesmiddelen in gesteriliseerd (noodzakelijk vanwege de immunodeficiëntie van de muizen) voedsel 24,37,41 of water 42,43,44,45,46 , die al dan niet chemisch compatibel zijn met veel antiretrovirale geneesmiddelen, of resulteren in iets dat de muizen niet gemakkelijk zouden eten of drinken (wat de dosis- en medicijnniveaus in het lichaam zou beïnvloeden). De nieuwe perorale cART-toedieningsmethode die hier wordt voorgesteld, overtreft eerdere toedieningspogingen vanwege de compatibiliteit met verschillende soorten antiretrovirale geneesmiddelen, de veiligheid en het gemak van voorbereiding en toediening, en de vermindering van stress en angst bij dieren als gevolg van de dagelijkse injectie.
Tenofovirdisoproxilfumaraat (TDF), Elvitegravir (ELV) en Raltegravir (RAL) zijn slecht in water oplosbare geneesmiddelen. Interessant is dat een verhoogde biologische beschikbaarheid van TDF wordt waargenomen met vet voedsel, wat suggereert dat competitieve remming van lipasen door vet voedsel een zekere bescherming voor TDF47 kan bieden. Daarom werden DietGel Boost-bekers geselecteerd om reguliere knaagdier chow te vervangen als de leveringsmethode op basis van hun bescheiden vetgehalte (20,3 g per 100 g) in vergelijking met gewone knaagdier chow (10 g per 100 g) en een typisch muis vetrijk dieet (40-60 g per 100 g)48. Het totale gewicht van één kopje is 75 g; dus elke beker bevat de hoeveelheid voedsel en dus het medicijn, voldoende voor vijf muizen gedurende 3 dagen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

De pandemie van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV-1) blijft zich wereldwijd onverminderd verspreiden en momenteel is er geen vaccin beschikbaar tegen HIV. Hoewel gecombineerde antiretrovirale therapie (cART) succesvol is geweest in het onderdrukken van virale replicatie, kan het het reservoir van HIV-geïnfecteerde personen niet volledig uitroeien. Een veilige en effectieve genezingsstrategie voor HIV-infectie vereist multipronged methoden, en daarom zijn de vooruitgang van diermodellen voor HIV-1-infectie cruciaal voor de ontwikkeling van hiv-genezingsonderzoek. Gehumaniseerde muizen recapituleren de belangrijkste kenmerken van hiv-1-infectie. Het gehumaniseerde muismodel kan worden geïnfecteerd door HIV-1 en virale replicatie kan worden gecontroleerd met cART-regimes. Bovendien resulteert cART-onderbreking in een snelle virale rebound bij gehumaniseerde muizen. Toediening van cART aan het dier kan echter ineffectief, moeilijk of toxisch zijn en veel klinisch relevante cART-regimes kunnen niet optimaal worden gebruikt. Naast het feit dat het potentieel onveilig is voor onderzoekers, veroorzaakt toediening van cART door een veelgebruikte intensieve dagelijkse injectieprocedure stress door fysieke beperking van het dier. De nieuwe orale cART-methode voor de behandeling van HIV-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen die in dit artikel worden beschreven, resulteerde in onderdrukking van viremie onder het detectieniveau, verhoogde snelheid van CD4 + -herstel en verbeterde algehele gezondheid bij HIV-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen.

Ervan uitgaande dat een gemiddelde muis met een gewicht van 25 g 4 g voedsel per dag consumeert, komt de dagelijkse geneesmiddeldosis via orale inname overeen met 2,88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC en 768 mg / kg RAL. Om te testen of het geoptimaliseerde voedselregime giftig is en de algehele gezondheid beïnvloedt in vergelijking met dagelijkse injectie van cART, werd het gewicht van muizen wekelijks vóór en tijdens cART gecontroleerd via orale of subcutane injectie. Er waren geen significante gewichtsverschillen vóór...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om orale gecombineerde antiretrovirale geneesmiddelen te leveren die met succes hiv-1-RNA-replicatie bij gehumaniseerde muizen onderdrukken.

Orale gecombineerde antiretrovirale behandeling bij hiv-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om orale combinatie antiretrovirale geneesmiddelen, of ART, te leveren die met succes hiv-RNA-replicatie in gehumaniseerde muizen onderdrukt. De nieuwe orale ART-methode overtreft eerdere leveringspogingen vanwege de veiligheid, het gemak van voorbereiding en toediening en verminderde dierlijke stress als gevolg van een dagelijkse injectie. De voorgestelde orale toedieningsmethode om HIV-RNA-replicatie bij gehumaniseerde muizen te onderdrukken, zal zeer waardevol zijn voor preklinische proof-of-concept-studies om nieuwe genezingsbehandelingen te ontwikkelen die de medicijnafgifte bij chronische HIV-geïnfecteerde personen nauw nabootsen.Valerie Rezak, labmanager en technicus van ons laboratorium, demonstreert de procedure. Begin met het wegen van individuele medicijnen. Maak 10 voedselbekers met cART met behulp van steriele celschrapers om 250 milligram FTC, 375 milligram TDF en 500 milligram RAL of ELV af te wegen in individuele, steriele centrifugebuizen van 50 milliliter in een bioveiligheidskast.Voeg DMSO toe aan de FTC- en TDF-buis om een eindconcentratie van 250 milligram per milliliter te vormen, en in de RAL- of ELV-buis tot een uiteindelijke concentratie van 500 milligram per milliliter. Meng de geneesmiddeloplossing door te roeren en pipetteren totdat een duidelijke oplossing is verkregen. Steriliseer de oplossingen met behulp van een hydrofiel PVDF-membraanfilter van 0,22 micrometer met een steriele spuit.Individuele medicijnoplossingen kunnen gedurende 12 weken bij min 20 graden Celsius worden bewaard. Ontdooi vers een aliquot van elke geneesmiddeloplossing voor gebruik bij 37 graden Celsius totdat de oplossing helder wordt. Meng goed met een pipet.Combineer de geneesmiddelen opgelost in DMSO en meng goed om een mastermix te maken met één milliliter FTC, 1,5 milliliter TDF en één milliliter ELV of RAL. Voeg 350 microliter cART-mastermixoplossing toe aan een kopje om één dieetgelboost cART-cup te bereiden. Voeg 0,75 milliliter trimethoprim sulfamethoxasole toe aan de cup.Roer grondig met steriele pipetpunten van één milliliter. Gebruik een pipetpunt om de voedselbeker met cART op een petrischaaltje van 60 millimeter te plaatsen. Bereken de hoeveelheid cART in de voedselbeker door het voedsel voor elke kooi te wegen op basis van het aantal muizen.Haal gewone chow uit de kooi en vervang deze door een voedselbeker met cART. Ververs cART-voedsel drie keer per week. Weeg gebruikte bekers om de inname te controleren.Weeg vervolgens de muizen wekelijks om de consumptie te bevestigen. Na vier weken hiv-1-infectie werden muizen nog eens 7,5 weken behandeld, hetzij met FTC / TDF / RAL-regime via subcutane injectie of door orale toediening van FTC / TDF / RAL of FTC / TDF / ELV. Het gewicht van de muis nam voortdurend af tijdens de dagelijkse cART subcutane injectie.Dieetgel daarentegen herstelde het gewicht van de muis tot pre-ART-initiatieniveaus na vijf weken orale toediening van cART. Bovendien werden geen significante gewichtsveranderingen waargenomen tussen RAL- of ELV-groepen. Binnen vier weken onderdrukten de FTC/ TDF / ELV en RAL / ART-voedingsregime de virale replicatie met respectievelijk 100% en 80%.70% van de muizen die SC-injectie kregen, bereikte na vier weken behandeling niet-detecteerbare niveaus. De resultaten bevestigden dat orale toediening virale replicatie sneller en efficiënter onderdrukte dan subcutane injecties. Bovendien voorkwam het cART-voedingsregime de verdere daling van CD4- tot CD8-verhoudingen in het perifere bloed eerder dan dagelijkse injecties.Het is van cruciaal belang om de steriliteit van elk materiaal dat betrokken is bij het protocol tijdens het hele proces te behouden en meervoudige bevriezing en dooi van de cART-stamoplossing te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...