Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
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Nous tenons à remercier les Drs Romas Geleziunas et Jeff Murry ainsi que les employés de Gilead pour avoir fourni les médicaments antirétroviraux utilisés dans cette étude. Ce travail a été financé par NCI 1R01CA239261-01 (à Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core et Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (à Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Ce travail a également été soutenu par le UCLA AIDS Institute, le James B. Pendleton Charitable Trust et la McCarthy Family Foundation.

Des tissus fœtaux humains anonymisés ont été acquis commercialement. La recherche sur les animaux a été menée conformément aux protocoles approuvés par l’Université de Californie à Los Angeles et le Comité de recherche animale (ARC) de l’UCLA, conformément à toutes les directives fédérales, étatiques et locales. Plus précisément, toutes les expériences ont été menées conformément aux recommandations et aux lignes directrices pour l’hébergement et les soins des animaux de laboratoire des Nat...

Une méthode d’administration orale de cART est développée ici pour les souris humanisées infectées par le VIH-1 en combinant trois médicaments antirétroviraux dans des aliments riches en nutriments. Par rapport à l’administration par injections quotidiennes, l’administration orale est plus facile à utiliser, limite la fréquence d’administration, réduit la manipulation des animaux, minimise le stress et améliore la sécurité55. Jusqu’à présent, seules quelques études sur d...

L’espérance de vie des personnes infectées par le virus de l’immunodéficience humaine chronique (VIH) s’est considérablement améliorée grâce au traitement antirétroviral combiné (TARc)1,2. cART réduit avec succès la réplication du VIH-1 et augmente le nombre de lymphocytes T CD4+ jusqu’à la normale chez la majorité des participants infectés de façon chronique par le VIH-13, ce qui entraîne une amélioration de la santé globale et une réduction spectaculaire de la progression de la maladie4. Cependant, le réservoir latent du VIH-1 est établi même lorsque le TAR est initié pendant l’infection aiguë 5,6,7. Les réservoirs persistent pendant des années pendant le TAR et le rebond viral rapide après l’interruption du TAR est bien documenté 8,9. Les personnes vivant avec le VIH sous TAR sont également prédisposées à un risque plus élevé de comorbidités telles que les maladies cardiovasculaires, le cancer et les troubles neurologiques10,11,12. Par conséquent, un remède fonctionnel contre le VIH est nécessaire. Les modèles animaux pour l’infection par le VIH-1 offrent des avantages évidents dans l’élaboration et la validation de nouvelles stratégies de guérison du VIH13,14,15. Les souris humanisées, en tant que modèle de petit animal, peuvent fournir une reconstitution de cellules immunitaires humaines multilignées dans différents tissus, ce qui permet d’étudier de près l’infection par le VIH16,17,18,19. Parmi les modèles humanisés, le modèle humanisé de la moelle osseuse, du foie et du thymus (BLT) récapitule avec succès l’infection chronique par le VIH-1 ainsi que les réponses immunitaires humaines fonctionnelles à l’infection par le VIH-1 20,21,22,23,24. Par conséquent, le modèle murin BLT humanisé a été largement utilisé pour étudier divers aspects dans le domaine de la recherche sur le VIH. Les souris BLT humanisées ne sont pas seulement des modèles bien établis pour la récapitulation de l’infection persistante par le VIH-1 et la pathogenèse, mais aussi des outils conséquents pour l’évaluation des stratégies d’intervention basées sur la thérapie cellulaire. Les auteurs actuels et d’autres ont démontré que le modèle humanisé des souris BLT récapitule l’infection persistante par le VIH-1 et la pathogenèse 25,26,27 et fournit des outils pour évaluer les stratégies d’intervention basées sur la thérapie cellulaire 28,29,30,31,32,33. 
Les schémas thérapeutiques cART consistant en des combinaisons de médicaments antirétroviraux pris quotidiennement suppriment la réplication du VIH-1 au point que la charge virale chez les personnes traitées avec succès reste indétectable à long terme34. Les résultats du traitement de souris humanisées infectées par le VIH avec des schémas thérapeutiques cART cliniquement pertinents ressemblent à ceux observés chez les personnes infectées par le VIH-1 traitées par TAR22 : Les taux de VIH-1 sont supprimés en dessous des limites de détection et l’interruption du TAR entraîne un rebond de la réplication du VIH à partir du réservoir latent35. L’injection sous-cutanée (SC)27,36,37 ou intrapéritonéale (IP)37,38,39 est la voie couramment utilisée pour le traitement antirétroviral chez les souris humanisées. Cependant, l’injection quotidienne intensive induit un stress chez les animaux par la contention physique40. Il est également exigeant en main-d’œuvre et potentiellement dangereux pour les chercheurs en raison de l’exposition accrue au VIH lors de l’utilisation d’objets tranchants. L’administration orale est idéale pour imiter l’absorption, la distribution et l’excrétion des médicaments antirétroviraux pris par les personnes infectées par le VIH-1. L’administration orale implique généralement des procédures personnalisées et souvent laborieuses pour mettre les médicaments antirétroviraux dans des aliments stérilisés (nécessaires en raison de l’immunodéficience des souris) 24,37,41 ou de l’eau 42,43,44,45,46 , qui peut ou non être chimiquement compatible avec de nombreux médicaments antirétroviraux, ou entraîner quelque chose que les souris ne mangeraient pas ou ne boiraient pas facilement (ce qui affecterait la dose et les niveaux de médicament dans le corps). La nouvelle méthode d’administration perorale de cART proposée ici surpasse les tentatives d’administration précédentes en raison de sa compatibilité avec différents types de médicaments antirétroviraux, de son innocuité et de sa facilité de préparation et d’administration, ainsi que de la réduction du stress et de l’anxiété chez les animaux résultant de l’injection quotidienne.
Le fumarate de ténofovir disoproxil (TDF), l’elvitégravir (ELV) et le raltégravir (RAL) sont des médicaments peu solubles dans l’eau. Fait intéressant, une biodisponibilité accrue du TDF est observée avec les aliments gras, ce qui suggère que l’inhibition compétitive des lipases par les aliments gras peut fournir une certaine protection contre le TDF47. Par conséquent, les gobelets DietGel Boost ont été choisis pour remplacer le chow de rongeur ordinaire comme méthode d’administration en fonction de leur teneur modeste en matières grasses (20,3 g pour 100 g) par rapport au chow de rongeur ordinaire (10 g pour 100 g) et à un régime alimentaire typique de souris riche en graisses (40-60 g pour 100 g)48. Le poids total d’une tasse est de 75 g; Ainsi, chaque tasse contiendra la quantité de nourriture, et donc de médicament, suffisante pour cinq souris sur 3 jours.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

La pandémie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) continue de se propager sans relâche dans le monde entier et, à l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin contre le VIH. Bien que la thérapie antirétrovirale combinée (cART) ait réussi à supprimer la réplication virale, elle ne peut pas éradiquer complètement le réservoir des personnes infectées par le VIH. Une stratégie de guérison sûre et efficace de l’infection par le VIH nécessitera des méthodes à plusieurs volets et, par conséquent, les progrès des modèles animaux pour l’infection par le VIH-1 sont essentiels au développement de la recherche sur la guérison du VIH. Les souris humanisées récapitulent les principales caractéristiques de l’infection par le VIH-1. Le modèle murin humanisé peut être infecté par le VIH-1 et la réplication virale peut être contrôlée par des schémas thérapeutiques cART. De plus, l’interruption de la cART entraîne un rebond viral rapide chez les souris humanisées. Cependant, l’administration de cART à l’animal peut être inefficace, difficile ou toxique, et de nombreux schémas thérapeutiques de TAR cliniquement pertinents ne peuvent pas être utilisés de manière optimale. En plus d’être potentiellement dangereuse pour les chercheurs, l’administration de cART par une procédure d’injection quotidienne intensive couramment utilisée induit un stress par contention physique de l’animal. La nouvelle méthode orale cART pour traiter les souris humanisées infectées par le VIH-1 décrite dans cet article a entraîné une suppression de la virémie inférieure au seuil de détection, une augmentation du taux de restauration du CD4+ et une amélioration de la santé globale chez les souris humanisées infectées par le VIH-1.

En supposant qu’une souris pesant moyenne 25 g consomme 4 g de nourriture par jour, la dose quotidienne de médicament par voie orale correspond à 2,88 mg / kg de TFV, 83 mg / kg FTC et 768 mg / kg RAL. Pour vérifier si le régime alimentaire optimisé est toxique et influence la santé globale par rapport à l’injection quotidienne de cART, le poids des souris a été surveillé chaque semaine avant et pendant le TAR par injection orale ou sous-cutanée. Il n’y avait pas de différence de poids significative ava...

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Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour administrer des médicaments antirétroviraux combinés oraux qui suppriment avec succès la réplication de l’ARN du VIH-1 chez des souris humanisées.

Traitement antirétroviral combiné oral chez des souris humanisées infectées par le VIH-1

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Ce protocole décrit une nouvelle méthode d’administration de médicaments antirétroviraux combinés oraux, ou TAR, qui supprime avec succès la réplication de l’ARN du VIH chez des souris humanisées. La nouvelle méthode orale de TAR surpasse les tentatives d’accouchement précédentes en raison de son innocuité, de sa facilité de préparation et d’administration et de la réduction du stress des animaux résultant d’une injection quotidienne. La méthode d’administration orale proposée pour supprimer la réplication de l’ARN du VIH chez les souris humanisées sera très utile pour les études précliniques de preuve de concept visant à mettre au point de nouveaux traitements curatifs qui imitent étroitement l’administration du médicament chez les personnes infectées par le VIH chronique.La démonstration de la procédure sera Valerie Rezak, gestionnaire de laboratoire et technicienne de notre laboratoire. Commencez par peser les médicaments individuels. Fabriquez 10 gobelets alimentaires avec cART à l’aide de racleurs à cellules stériles pour peser 250 milligrammes de FTC, 375 milligrammes de TDF et 500 milligrammes de RAL ou d’ELV dans des tubes centrifugés individuels stériles de 50 millilitres dans une armoire de biosécurité.Ajouter du DMSO au tube FTC et TDF pour obtenir une concentration finale de 250 milligrammes par millilitre, et dans le tube RAL ou ELV à une concentration finale de 500 milligrammes par millilitre. Mélanger la solution médicamenteuse en agitant et en pipetant jusqu’à l’obtention d’une solution limpide. Stériliser les solutions à l’aide d’un filtre à membrane en PVDF hydrophile de 0,22 micromètre avec une seringue stérile.Les solutions médicamenteuses individuelles peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius pendant 12 semaines. Décongeler fraîchement une partie aliquote de chaque solution médicamenteuse avant utilisation à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la solution devienne claire. Bien mélanger à l’aide d’une pipette.Combinez les médicaments dissous dans le DMSO et mélangez bien pour former un mélange principal contenant un millilitre de FTC, 1,5 millilitre de TDF et un millilitre de VLE ou RAL. Ajouter 350 microlitres de solution de mélange principal cART dans une tasse pour préparer une tasse de gel diététique boost cART. Ajouter 0,75 millilitres de triméthoprime sulfaméthoxasole dans la tasse.Bien mélanger à l’aide d’embouts de pipettes stériles d’un millilitre. À l’aide d’un embout de pipette, aliquoter le gobelet contenant cART sur une boîte de Petri de 60 millimètres. Calculez la quantité de cART dans le gobelet alimentaire en pesant la nourriture pour chaque cage en fonction du nombre de souris.Retirez le chow ordinaire de la cage et remplacez-le par un gobelet contenant du cART. Rafraîchissez les aliments cART trois fois par semaine. Peser les tasses usagées pour surveiller la consommation.Ensuite, pesez les souris chaque semaine pour confirmer la consommation. Après quatre semaines d’infection par le VIH-1, les souris ont été traitées pendant 7,5 semaines supplémentaires, soit avec un schéma FTC/TDF/RAL par injection sous-cutanée, soit par administration orale de FTC/TDF/RAL ou FTC/TDF/ELV. Le poids de la souris diminuait continuellement pendant l’injection sous-cutanée quotidienne de cART.En revanche, le gel diététique a rétabli le poids de la souris aux niveaux d’initiation pré-TAR après cinq semaines d’administration orale de cART. De plus, aucun changement de poids significatif n’a été observé entre les groupes RAL ou VLE. En quatre semaines, le régime alimentaire FTC/TDF/ELV et RAL/ART a supprimé la réplication virale de 100 % et 80 % respectivement.70% des souris recevant une injection SC ont atteint des niveaux indétectables après quatre semaines de traitement. Les résultats ont confirmé que l’administration orale supprimait la réplication virale plus rapidement et plus efficacement que les injections sous-cutanées. De plus, le régime alimentaire cART a empêché la baisse des rapports CD4/CD8 dans le sang périphérique plus tôt que les injections quotidiennes.Il est essentiel de maintenir la stérilité de tout matériau impliqué dans le protocole pendant tout le processus et d’éviter les multiples gels et décongélations de la solution mère cART.

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