Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר רומאס גלזיונאס ולג'ף מורי ולאנשים בגיליאד על אספקת התרופות האנטי-רטרו-ויראליות ששימשו במחקר זה. עבודה זו מומנה על ידי NCI 1R01CA239261-01 (למטבח), מענקי NIH P30AI28697 (ליבת הווירולוגיה של UCLA CFAR, ליבת הטיפול בגנים ותאים, וליבת עכבר אנושית), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (לג'ן), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (קאריו). עבודה זו נתמכה גם על ידי מכון האיידס של UCLA, קרן הצדקה על שם ג'יימס ב. פנדלטון וקרן משפחת מקארתי.

רקמת עובר אנושית אנונימית נרכשה באופן מסחרי. המחקר בבעלי חיים בוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, וועדת המחקר בבעלי חיים (UCLA) (ARC) בהתאם לכל ההנחיות הפדרליות, המדינתיות והמקומיות. באופן ספציפי, כל הניסויים בוצעו בהתאם להמלצות ולהנחיות לדיור וטיפול בחיות מעב...

שיטת מתן cART דרך הפה מפותחת כאן עבור עכברים נגועים ב- HIV-1 על ידי שילוב של שלוש תרופות אנטי-רטרו-ויראליות בתוך מזון עשיר בחומרים מזינים. בהשוואה למתן על ידי זריקות יומיות, משלוח דרך הפה קל יותר לשימוש, מגביל את תדירות הניהול, מפחית את הטיפול בבעלי חיים, ממזער מתח ומשפר את הבטיחות55. ...

תוחלת החיים של אנשים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי הכרוני (HIV) השתפרה באופן משמעותי עם טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART)1,2. cART מפחית בהצלחה את שכפול ה- HIV-1 ומגדיל את ספירת תאי ה- CD4+ T לנורמליות אצל רוב המשתתפים הנגועים ב- HIV-1 באופן כרוני3, וכתוצאה מכך בריאות כללית משופרת והפחתה דרמטית בהתקדמות המחלה4. עם זאת, מאגר HIV-1 סמוי נוצר גם כאשר ART הוא יזם במהלך זיהום חריף 5,6,7. המאגרים נמשכים לאורך שנים במהלך ART וריבאונד נגיפי מהיר לאחר שהפרעת ART מתועדת היטב 8,9. אנשים החיים עם HIV על ART הם גם נטייה לסיכון גבוה יותר של תחלואה נלווית כגון מחלות לב וכלי דם, סרטן, והפרעות נוירו10,11,12. לכן, יש צורך בתרופה פונקציונלית ל- HIV. מודלים של בעלי חיים לזיהום ב- HIV-1 מציעים יתרונות ברורים בפיתוח ואימות אסטרטגיות ריפוי HIV חדשניות13,14,15. עכברים אנושיים, כמודל של חיה קטנה, יכולים לספק שחזור תאי חיסון אנושיים רב-שכבתיים ברקמות שונות, מה שמאפשר מחקר מקרוב של הידבקות ב- HIV16,17,18,19. מבין המודלים האנושיים, המודל האנושי של מח עצם-כבד-תימוס (BLT) משחזר בהצלחה זיהום כרוני ב-HIV-1, כמו גם תגובות חיסוניות אנושיות פונקציונליות לזיהום ב-HIV-1 20,21,22,23,24. לכן, מודל עכבר BLT האנושי נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור היבטים שונים בתחום המחקר של HIV. עכברי BLT אנושיים הם לא רק מודלים מבוססים היטב לסיכום של זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה, אלא גם כלים תוצאתיים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול בתאים. המחברים הנוכחיים ואחרים הראו כי מודל עכברי BLT האנושיים משחזר זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה 25,26,27 ומספק כלים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול תאי 28,29,30,31,32,33. 
משטרי cART המורכבים משילובים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות הנלקחות מדי יום מדכאות שכפול HIV-1 עד כדי כך שהעומס הנגיפי אצל אנשים שטופלו בהצלחה נותר בלתי ניתן לגילוי לאורךזמן 34. התוצאות של טיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV עם משטרי cART רלוונטיים מבחינה קלינית דומות לאלה שנצפו אצל אנשים נגועים ב- HIV-1 שטופלו ב- ART22: רמות HIV-1 מדוכאות מתחת לגבולות הגילוי וההפרעה של cART גורמת לריבאונד של שכפול HIV מהמאגר הסמוי35. הזרקה תת-עורית (SC)27,36,37 או תוך-צפקית (IP)37,38,39 היא המסלול המשמש בדרך כלל לטיפול ב-cART בעכברים אנושיים. עם זאת, הזרקה יומית אינטנסיבית גורמת ללחץ על בעלי חיים על ידי ריסון פיזי40. היא גם דורשת עבודה רבה ועלולה להיות לא בטוחה לחוקרים בשל חשיפה מוגברת ל-HIV תוך שימוש בחדים. מתן אוראלי הוא אידיאלי כדי לחקות את הספיגה, ההפצה וההפרשה של תרופות cART כי הם נלקחים על ידי אנשים נגועים ב- HIV-1. מתן אוראלי כולל בדרך כלל הליכים מותאמים אישית ולעתים קרובות מייגעים כדי לשים את התרופות antiretroviral מעוקר (הכרחי בשל הכשל החיסוני של העכברים) מזון 24,37,41 או מים 42,43,44,45,46 אשר עשוי או לא יכול להיות תואם כימית עם תרופות אנטי-רטרו-ויראליות רבות, או לגרום למשהו שהעכברים לא יאכלו או ישתו בקלות (מה שישפיע על רמות המינון והתרופות בגוף)., שיטת ניהול ה- cART הפרולית החדשנית המוצעת כאן עולה על ניסיונות אספקה קודמים בשל תאימותה לסוגים שונים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות, בטיחות וקלות הכנה וניהולם, והפחתת מתח וחרדה של בעלי חיים הנובעים מההזרקה היומית.
Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) ו- Raltegravir (RAL) הן תרופות מסיסות במים. באופן מעניין, הזמינות הביולוגית המוגברת של TDF נצפתה עם מזונות שומניים, מה שמרמז על כך שעיכוב תחרותי של ליפאזות על ידי מזון שומני עשוי לספק הגנה מסוימת ל-TDF47. לכן, כוסות DietGel Boost נבחרו להחליף צ'או מכרסם רגיל כשיטת אספקה המבוססת על תכולת השומן הצנועה שלהן (20.3 גרם ל-100 גרם) בהשוואה לצ'או מכרסמים רגיל (10 גרם ל-100 גרם) ודיאטה טיפוסית עתירת שומן של עכברים (40-60 גרם ל-100 גרם)48. המשקל הכולל של אחת הוא 75 גרם; לפיכך, כל תכיל את כמות המזון, ולכן תרופות, מספיק עבור 5 עכברים במשך 3 ימים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

מגפת נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) ממשיכה להתפשט ללא הפרעה ברחבי העולם, ונכון לעכשיו, אין חיסון זמין נגד HIV. למרות שטיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART) הצליח לדכא שכפול נגיפי, הוא אינו יכול למגר לחלוטין את המאגר מאנשים נגועים ב- HIV. אסטרטגיית ריפוי בטוחה ויעילה להידבקות ב- HIV תדרוש שיטות רב-תכליתיות, ולכן ההתקדמות של מודלים חייתיים לזיהום ב- HIV-1 הם מרכזיים לפיתוח מחקר ריפוי HIV. עכברים אנושיים משחזרים תכונות מרכזיות של הידבקות ב- HIV-1. מודל העכבר האנושי יכול להיות נגוע ב- HIV-1 וניתן לשלוט בשכפול הנגיף באמצעות משטרי cART. יתר על כן, הפרעה ל-cART גורמת לריבאונד נגיפי מהיר בעכברים אנושיים. עם זאת, מתן cART לבעל החיים יכול להיות לא יעיל, קשה או רעיל, ומשטרי cART רלוונטיים רבים מבחינה קלינית אינם ניתנים לניצול מיטבי. לצד היותו עלול להיות לא בטוח עבור חוקרים, מתן cART על ידי הליך הזרקה יומי אינטנסיבי נפוץ גורם ללחץ על ידי ריסון פיזי של החיה. שיטת cART האוראלית החדשנית לטיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1 המתוארת במאמר זה הביאה לדיכוי של וירמיה מתחת לרמת הזיהוי, לשיעור מוגבר של שחזור CD4+ ולשיפור הבריאות הכללית בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1.

בהנחה שעכבר ממוצע השוקל 25 גרם צורך 4 גרם מזון ביום, מינון התרופה היומית באמצעות צריכה פומית מתאים ל-2.88 מ"ג/ק"ג TFV, 83 מ"ג/ק"ג FTC ו-768 מ"ג/ק"ג RAL. כדי לבחון אם משטר המזון הממוטב רעיל ומשפיע על הבריאות הכללית בהשוואה להזרקה יומית של cART, משקל העכברים היה מנוטר מדי שבוע לפני ובמהלך cART באמצעות הזרקה דרך ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית להעברת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות משולבות דרך הפה המדכאות בהצלחה שכפול RNA של HIV-1 בעכברים אנושיים.

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית להעברת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות משולבות דרך הפה, או ART, המדכאת בהצלחה שכפול HIV RNA בעכברים אנושיים. שיטת ART האוראלית החדשנית עולה על ניסיונות לידה קודמים בשל בטיחותה, קלות ההכנה והניהול שלה, והפחתת הלחץ על בעלי חיים כתוצאה מהזרקה יומית. שיטת המסירה האוראלית המוצעת לדיכוי שכפול RNA של HIV בעכברים אנושיים תהיה בעלת ערך רב למחקרי הוכחת היתכנות פרה-קליניים לפיתוח טיפולי ריפוי חדשניים המחקים באופן הדוק את אספקת התרופה אצל אנשים הנגועים ב- HIV כרוני.מי שתדגים את ההליך תהיה ולרי רזאק, מנהלת מעבדה וטכנאית מהמעבדה שלנו. התחל על ידי שקילת תרופות בודדות. הכינו 10 כוסות מזון עם cART באמצעות מגרדי תאים סטריליים כדי לשקול 250 מיליגרם של FTC, 375 מיליגרם של TDF ו-500 מיליגרם של RAL או ELV לצינורות צנטריפוגה בודדים סטריליים של 50 מיליליטר בארון בטיחות ביולוגי.הוסף DMSO לצינור FTC ו- TDF כדי ליצור ריכוז סופי של 250 מיליגרם למיליליטר, ולתוך צינור RAL או ELV לריכוז סופי של 500 מיליגרם למיליליטר. מערבבים את תמיסת התרופה על ידי ערבוב ופיפטינג עד לקבלת תמיסה ברורה. לעקר את התמיסות באמצעות מסנן קרום PVDF הידרופילי בגודל 0.22 מיקרומטר עם מזרק סטרילי.פתרונות סמים בודדים ניתן לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 12 שבועות. הפשרה טרייה של אליקוט אחד מכל תמיסת תרופה לפני השימוש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהפתרון מתבהר. מערבבים היטב באמצעות פיפטה.שלב את התרופות המומסות ב- DMSO וערבב היטב כדי ליצור תערובת מאסטר המכילה מיליליטר אחד של FTC, 1.5 מיליליטר של TDF, ומיליליטר אחד של ELV או RAL. הוסיפו 350 מיקרוליטרים של תמיסת תערובת מאסטר cART לכוס כדי להכין cART אחת עם ג'ל דיאטה. הוסיפו לכוס 0.75 מיליליטר של טרימתופרים סולפאמתוקסאסול.ערבבו היטב בעזרת קצוות פיפטה סטריליים של מיליליטר אחד. בעזרת קצה פיפטה, העלו את המזון המכילה cART על צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטרים. חשב את כמות ה- cART בגביע המזון על ידי שקילת המזון עבור כל כלוב בהתאם למספר העכברים.הוציאו צ'או רגיל מהכלוב והחליפו אותו בכוס מזון המכילה cART. רעננו את האוכל של cART שלוש פעמים בשבוע. שקלו כוסות משומשות כדי לעקוב אחר הצריכת.לאחר מכן, שקלו את העכברים מדי שבוע כדי לאשר את הצריכה. לאחר ארבעה שבועות של הידבקות ב-HIV-1, עכברים טופלו במשך 7.5 שבועות נוספים, בין אם באמצעות משטר FTC/TDF/RAL באמצעות הזרקה תת עורית או על ידי מתן פומי של FTC/TDF/RAL או FTC/TDF/ELV. משקל העכבר ירד ללא הרף במהלך הזרקה תת עורית יומית של cART.לעומת זאת, ג'ל הדיאטה החזיר את משקל העכברים לרמות טרום-ART לאחר חמישה שבועות של מתן cART דרך הפה. בנוסף, לא נצפו שינויים משמעותיים במשקל בין קבוצות RAL או ELV. בתוך ארבעה שבועות, משטר המזון FTC/TDF/ELV ו-RAL/ART דיכא את שכפול הנגיף ב-100% וב-80% בהתאמה.70% מהעכברים שקיבלו זריקת SC הגיעו לרמות בלתי ניתנות לגילוי לאחר ארבעה שבועות של טיפול. התוצאות אישרו כי מתן פומי דיכא את שכפול הנגיף מהר יותר וביעילות רבה יותר מאשר זריקות תת עוריות. יתר על כן, משטר המזון cART מנע ירידה נוספת של יחס CD4 ל- CD8 בדם ההיקפי מוקדם יותר מזריקות יומיות.זה קריטי לשמור על סטריליות של כל חומר המעורב בפרוטוקול במהלך כל התהליך ולמנוע הקפאה והפשרה מרובות של תמיסת מלאי cART.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...