Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
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Vorremmo ringraziare i dottori Romas Geleziunas e Jeff Murry e le persone di Gilead per aver fornito i farmaci antiretrovirali utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato finanziato da NCI 1R01CA239261-01 (a Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core e Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (a Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'UCLA AIDS Institute, dal James B. Pendleton Charitable Trust e dalla McCarthy Family Foundation.

Il tessuto fetale umano anonimizzato è stato acquisito commercialmente. La ricerca sugli animali è stata condotta secondo i protocolli approvati dall'Università della California, Los Angeles, e (UCLA) Animal Research Committee (ARC) in conformità con tutte le linee guida federali, statali e locali. In particolare, tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni e le linee guida per l'alloggio e la cura degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH) e dell'Associaz...

Un metodo di somministrazione orale di cART è stato sviluppato qui per topi umanizzati infetti da HIV-1 combinando tre farmaci antiretrovirali all'interno di alimenti ad alto contenuto di nutrienti. Rispetto alla somministrazione tramite iniezioni giornaliere, la somministrazione orale è più facile da usare, limita la frequenza di somministrazione, riduce la manipolazione degli animali, riduce al minimo lo stress e migliora la sicurezza55. Fino a questo punto, solo pochi studi su topi umanizzat...

L'aspettativa di vita degli individui con infezione da virus dell'immunodeficienza umana cronica (HIV) è significativamente migliorata con il trattamento antiretrovirale combinato (cART)1,2. cART riduce con successo la replicazione dell'HIV-1 e aumenta la conta delle cellule T CD4+ alla normalità nella maggior parte dei partecipanti con infezione cronica da HIV-13, con conseguente miglioramento della salute generale e drastica riduzione della progressione della malattia4. Tuttavia, il serbatoio latente di HIV-1 si stabilisce anche quando l'ART viene iniziata durante l'infezione acuta 5,6,7. I serbatoi persistono negli anni durante l'ART e il rapido rimbalzo virale dopo l'interruzione dell'ART è ben documentato 8,9. Le persone che vivono con l'HIV in ART sono anche predisposte a un rischio più elevato di comorbidità come malattie cardiovascolari, cancro e disturbi neurologici10,11,12. Pertanto, è necessaria una cura funzionale per l'HIV. I modelli animali per l'infezione da HIV-1 offrono evidenti vantaggi nello sviluppo e nella convalida di nuove strategie di cura dell'HIV13,14,15. I topi umanizzati, come un piccolo modello animale, possono fornire la ricostituzione multilineare delle cellule immunitarie umane in diversi tessuti, che consente lo studio ravvicinato dell'infezione da HIV16,17,18,19. Tra i modelli umanizzati, il modello umanizzato midollo osseo-fegato-timo (BLT) ricapitola con successo l'infezione cronica da HIV-1 e le risposte immunitarie umane funzionali all'infezione da HIV-1 20,21,22,23,24. Pertanto, il modello murino BLT umanizzato è stato ampiamente utilizzato per indagare vari aspetti nel campo della ricerca sull'HIV. I topi BLT umanizzati non sono solo modelli consolidati per la ricapitolazione dell'infezione persistente da HIV-1 e della patogenesi, ma anche strumenti consequenziali per la valutazione delle strategie di intervento basate sulla terapia cellulare. Gli autori attuali e altri hanno dimostrato che il modello umanizzato di topi BLT ricapitola l'infezione persistente da HIV-1 e la patogenesi 25,26,27 e fornisce strumenti per valutare le strategie di intervento basate sulla terapia cellulare 28,29,30,31,32,33. 
I regimi di cART costituiti da combinazioni di farmaci antiretrovirali assunti quotidianamente sopprimono la replicazione dell'HIV-1 al punto che la carica virale negli individui trattati con successo rimane non rilevabile a lungo termine34. I risultati del trattamento di topi umanizzati con infezione da HIV con regimi di cART clinicamente rilevanti assomigliano a quelli osservati negli individui trattati con ART infetti da HIV-122: i livelli di HIV-1 sono soppressi al di sotto dei limiti di rilevazione e l'interruzione di cART provoca un rimbalzo della replicazione dell'HIV dal serbatoio latente35. L'iniezione sottocutanea (SC)27,36,37 o intraperitoneale (IP)37,38,39 è la via comunemente usata per il trattamento cART nei topi umanizzati. Tuttavia, l'iniezione giornaliera intensiva induce stress agli animali per contenzione fisica40. È anche laborioso e potenzialmente pericoloso per i ricercatori a causa della maggiore esposizione all'HIV durante l'utilizzo di oggetti taglienti. La somministrazione orale è ideale per imitare l'assorbimento, la distribuzione e l'escrezione dei farmaci cART assunti da individui con infezione da HIV-1. La somministrazione orale comporta tipicamente procedure personalizzate e spesso laboriose per mettere i farmaci antiretrovirali in alimenti sterilizzati (necessari a causa dell'immunodeficienza dei topi) 24,37,41 o acqua 42,43,44,45,46 , che può o non può essere chimicamente compatibile con molti farmaci antiretrovirali, o provocare qualcosa che i topi non mangerebbero o berrebbero prontamente (il che influenzerebbe i livelli di dose e farmaco nel corpo). Il nuovo metodo di somministrazione perorale di cART qui proposto supera i precedenti tentativi di somministrazione grazie alla sua compatibilità con diversi tipi di farmaci antiretrovirali, alla sicurezza e alla facilità di preparazione e somministrazione e alla riduzione dello stress e dell'ansia degli animali derivanti dall'iniezione giornaliera.
Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) e Raltegravir (RAL) sono farmaci scarsamente solubili in acqua. È interessante notare che si osserva una maggiore biodisponibilità di TDF con cibi grassi, suggerendo che l'inibizione competitiva delle lipasi da parte del cibo grasso può fornire una certa protezione per TDF47. Pertanto, le coppette DietGel Boost sono state selezionate per sostituire il normale chow di roditori come metodo di consegna basato sul loro modesto contenuto di grassi (20,3 g per 100 g) rispetto al normale roditore (10 g per 100 g) e una tipica dieta ricca di grassi per topi (40-60 g per 100 g)48. Il peso totale di una tazza è di 75 g; Pertanto, ogni tazza conterrà la quantità di cibo, e quindi di droga, sufficiente per cinque topi in 3 giorni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

La pandemia del virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1) continua a diffondersi senza sosta in tutto il mondo e attualmente non esiste un vaccino disponibile contro l'HIV. Sebbene la terapia antiretrovirale combinata (cART) abbia avuto successo nel sopprimere la replicazione virale, non può sradicare completamente il serbatoio da individui con infezione da HIV. Una strategia di cura sicura ed efficace per l'infezione da HIV richiederà metodi su più fronti, e quindi i progressi dei modelli animali per l'infezione da HIV-1 sono fondamentali per lo sviluppo della ricerca sulla cura dell'HIV. I topi umanizzati ricapitolano le caratteristiche chiave dell'infezione da HIV-1. Il modello murino umanizzato può essere infettato da HIV-1 e la replicazione virale può essere controllata con regimi cART. Inoltre, l'interruzione della cART provoca un rapido rimbalzo virale nei topi umanizzati. Tuttavia, la somministrazione di cART all'animale può essere inefficace, difficile o tossica e molti regimi di cART clinicamente rilevanti non possono essere utilizzati in modo ottimale. Oltre ad essere potenzialmente pericoloso per i ricercatori, la somministrazione di cART mediante una procedura di iniezione giornaliera intensiva comunemente usata induce stress da contenzione fisica dell'animale. Il nuovo metodo orale cART per il trattamento di topi umanizzati infetti da HIV-1 descritto in questo articolo ha portato alla soppressione della viremia al di sotto del livello di rilevamento, all'aumento del tasso di ripristino di CD4 + e al miglioramento della salute generale nei topi umanizzati infetti da HIV-1.

Supponendo che un topo medio del peso di 25 g consumi 4 g di cibo al giorno, la dose giornaliera di farmaco attraverso l'assunzione orale corrisponde a 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC e 768 mg/kg RAL. Per verificare se il regime alimentare ottimizzato è tossico e influenza la salute generale rispetto all'iniezione giornaliera di cART, il peso dei topi è stato monitorato settimanalmente prima e durante la cART attraverso l'iniezione orale o sottocutanea. Non ci sono state differenze di peso significative prima della sommin...

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Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per somministrare farmaci antiretrovirali combinati orali che sopprimono con successo la replicazione dell'RNA dell'HIV-1 nei topi umanizzati.

Trattamento antiretrovirale combinato orale in topi umanizzati infetti da HIV-1

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per somministrare farmaci antiretrovirali combinati orali, o ART, che sopprime con successo la replicazione dell'RNA dell'HIV nei topi umanizzati. Il nuovo metodo ART orale supera i precedenti tentativi di consegna grazie alla sua sicurezza, facilità di preparazione e somministrazione e ridotto stress animale derivante da un'iniezione giornaliera. Il metodo di somministrazione orale proposto per sopprimere la replicazione dell'RNA dell'HIV nei topi umanizzati sarà molto prezioso per studi preclinici proof-of-concept per sviluppare nuovi trattamenti di cura che imitino da vicino la somministrazione del farmaco in individui cronici con infezione da HIV.A dimostrare la procedura sarà Valerie Rezak, responsabile di laboratorio e tecnico del nostro laboratorio. Inizia pesando i singoli farmaci. Prepara 10 bicchieri alimentari con cART utilizzando raschietti per cellule sterili per pesare 250 milligrammi di FTC, 375 milligrammi di TDF e 500 milligrammi di RAL o ELV in singoli tubi da centrifuga sterili da 50 millilitri in un armadio di biosicurezza.Aggiungere DMSO al tubo FTC e TDF per ottenere una concentrazione finale di 250 milligrammi per millilitro e nel tubo RAL o ELV a una concentrazione finale di 500 milligrammi per millilitro. Mescolare la soluzione farmacologica agitando e pipettando fino ad ottenere una soluzione limpida. Sterilizzare le soluzioni utilizzando un filtro a membrana idrofilo PVDF da 0,22 micrometri con una siringa sterile.Le singole soluzioni farmacologiche possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius per 12 settimane. Scongelare appena un'aliquota di ciascuna soluzione farmacologica prima dell'uso a 37 gradi Celsius fino a quando la soluzione diventa limpida. Mescolare bene usando una pipetta.Combinare i farmaci sciolti in DMSO e mescolare bene per formare un master mix contenente un millilitro di FTC, 1,5 millilitri di TDF e un millilitro di ELV o RAL. Aggiungere 350 microlitri di soluzione master mix cART in una tazza per preparare una tazza di gel dietetico boost cART. Aggiungere 0,75 millilitri di trimetoprim sulfametossasolo nella tazza.Mescolare accuratamente con punte sterili da un millilitro. Utilizzando una punta di pipetta, aliquote il bicchiere contenente cART su una capsula di Petri da 60 millimetri. Calcola la quantità di cART nella tazza del cibo pesando il cibo per ogni gabbia in base al numero di topi.Rimuovere il chow normale dalla gabbia e sostituirlo con una tazza di cibo contenente cART. Rinfrescare il cibo cART tre volte a settimana. Pesare le tazze usate per monitorare l'assunzione.Quindi, pesare i topi settimanalmente per confermare il consumo. Dopo quattro settimane di infezione da HIV-1, i topi sono stati trattati per altre 7,5 settimane, con il regime FTC / TDF / RAL attraverso iniezione sottocutanea o mediante somministrazione orale di FTC / TDF / RAL o FTC / TDF / ELV. Il peso del topo diminuiva continuamente durante l'iniezione sottocutanea giornaliera di cART.Al contrario, il gel dietetico ha ripristinato il peso del topo ai livelli pre-inizio dell'ART dopo cinque settimane di somministrazione orale di cART. Inoltre, non sono state osservate variazioni significative di peso tra i gruppi RAL o ELV. Entro quattro settimane, il regime alimentare FTC/TDF/ELV e RAL/ART ha soppresso la replicazione virale rispettivamente del 100% e dell'80%.Il 70% dei topi che hanno ricevuto l'iniezione SC ha raggiunto livelli non rilevabili dopo quattro settimane di trattamento. I risultati hanno confermato che la somministrazione orale ha soppresso la replicazione virale in modo più rapido ed efficiente rispetto alle iniezioni sottocutanee. Inoltre, il regime alimentare cART ha impedito l'ulteriore declino dei rapporti CD4-CD8 nel sangue periferico prima delle iniezioni giornaliere.È fondamentale mantenere la sterilità di qualsiasi materiale coinvolto nel protocollo durante l'intero processo ed evitare il congelamento e lo scongelamento multipli della soluzione madre cART.

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