Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
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この研究で使用された抗レトロウイルス薬を提供してくれたRomas Geleziunas博士とJeff Murry博士、およびギリアドの人々に感謝します。この研究は、NCI 1R01CA239261-01 (to Kitchen)、NIH Grants P30AI28697 (the UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core, and Humanized Mouse Core)、U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen)、CIRM DISC2-10748、NIDA R01DA-52841 (to Zhen)、NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen)、IRACDA K12 GM106996 (Carrillo)によって資金提供された。この作業は、UCLAエイズ研究所、ジェームズB.ペンドルトン慈善信託、およびマッカーシー家族財団によっても支援されました。

匿名化されたヒト胎児組織は商業的に取得された。動物研究は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校および(UCLA)動物研究委員会(ARC)によって承認されたプロトコルに従って、すべての連邦、州、および地方のガイドラインに従って実施されました。具体的には、すべての実験は、国立衛生研究所(NIH)およびUCLA ARCプロトコル番号2010-038-02Bに基づく実験動物管理の評価および認定協会(AALAC)の実験...

ここでは、HIV-1に感染したヒト化マウスに対して、高栄養食品中に3つの抗レトロウイルス薬を組み合わせることにより、経口cART投与法を開発しています。毎日の注射による投与と比較して、経口送達は使いやすく、投与頻度を制限し、動物の取り扱いを減らし、ストレスを最小限に抑え、安全性を向上させます55。この時点まで、ヒト化マウス24,37,41における少数の研究の?...

慢性ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染者の平均余命は、抗レトロウイルス併用療法(cART)によって大幅に改善されました1,2。cARTは、HIV-1慢性感染参加者の大多数において、HIV-1複製を減少させ、CD4+ T細胞数を正常まで増加させることに成功し3、全体的な健康状態を改善し、疾患の進行を劇的に減少させました4。しかし、潜在性HIV-1リザーバーは、急性感染中にARTが開始された場合でも確立されます5,6,7。リザーバーはARTの間何年にもわたって持続し、ART中断後の急速なウイルスリバウンドは十分に文書化されています8,9。ARTでHIVと共に生きる人々はまた、心血管疾患、癌、神経障害などの併存疾患のリスクが高くなる傾向があります10,11,12。したがって、HIVの機能的治療法が必要です。HIV-1感染の動物モデルは、新しいHIV治療戦略の開発と検証において明らかな利点を提供します13,14,15。ヒト化マウスは、小動物モデルとして、異なる組織における多系列ヒト免疫細胞の再構成を提供することができ、これはHIV感染の綿密な研究を可能にする16、17、18、19。ヒト化モデルの中で、ヒト化骨髄-肝臓-胸腺(BLT)モデルは、慢性HIV-1感染とHIV-1感染に対する機能的なヒト免疫応答を首尾よく再現します20、21、22、23、24。したがって、ヒト化BLTマウスモデルは、HIV研究分野における様々な側面を調査するために広く使用されている。ヒト化BLTマウスは、持続的なHIV-1感染と病因の再現のための確立されたモデルであるだけでなく、細胞療法に基づく介入戦略を評価するための重要なツールでもあります。現在の著者らは、ヒト化BLTマウスモデルが持続的なHIV-1感染と病因を要約し25,26,27、細胞療法に基づく介入戦略を評価するためのツールを提供することを実証しました28,29,30,31,32,33。 
毎日服用される抗レトロウイルス薬の組み合わせからなるcARTレジメンは、HIV-1複製を抑制し、治療に成功した個人のウイルス量は長期間にわたって検出できないままである34。HIV感染ヒト化マウスを臨床的に関連するcARTレジメンで治療した結果は、HIV-1感染ART治療個体で観察されたものに類似している22:HIV-1レベルは検出限界以下に抑制され、cARTの中断は潜在リザーバー35からのHIV複製のリバウンドをもたらす。皮下(SC)27,36,37または腹腔内(IP)37,38,39注射は、ヒト化マウスのcART治療に一般的に使用される経路です。しかし、集中的な毎日の注射は、身体的拘束40によって動物にストレスを誘発する。また、鋭利物を使用している間、HIVへの曝露が増えるため、労働集約的であり、研究者にとって潜在的に安全ではありません。経口投与は、HIV-1感染者が服用するcART薬の吸収、分布、排泄を模倣するのに理想的です。経口投与は、典型的には、抗レトロウイルス薬を滅菌された(マウスの免疫不全のために必要)食物24、37、41または水42、43、44、45、46に入れるためのカスタマイズされた、しばしば面倒な手順を伴う。これは、多くの抗レトロウイルス薬と化学的に適合する場合とそうでない場合があり、マウスが容易に食べたり飲んだりしないものをもたらします(体内の用量と薬物レベルに影響します)。ここで提案する新規経口cART投与法は、さまざまな種類の抗レトロウイルス薬との適合性、安全性と調製と投与の容易さ、および毎日の注射に起因する動物のストレスと不安の軽減により、以前の送達の試みを上回っています。
テノホビルジソプロキシルフマル酸塩(TDF)、エルビテグラビル(ELV)、およびラルテグラビル(RAL)は難水溶性薬です。興味深いことに、脂肪分の多い食品ではTDFのバイオアベイラビリティの増加が観察され、脂肪分の多い食品によるリパーゼの競合的阻害がTDF47に一定の保護を提供する可能性があることを示唆しています。したがって、DietGel Boostカップは、通常のげっ歯類の飼料(100 gあたり10 g)および典型的なマウスの高脂肪食(100 gあたり40〜60 g)と比較して、適度な脂肪含有量(100 gあたり20.3 g)に基づいて、通常のげっ歯類の飼料の代わりに選択されました48。1カップの総重量は75gです。したがって、各カップには、3日間で5匹のマウスに十分な量の食物、したがって薬物が含まれます。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)のパンデミックは世界中に衰えることなく広がり続けており、現在、HIVに対するワクチンはありません。併用抗レトロウイルス療法(cART)はウイルス複製の抑制に成功していますが、HIV感染者からリザーバーを完全に根絶することはできません。HIV感染の安全で効果的な治療戦略には多面的な方法が必要であり、したがって、HIV-1感染の動物モデルの進歩は、HIV治療研究の発展にとって極めて重要です。ヒト化マウスは、HIV-1感染の重要な特徴を再現しています。ヒト化マウスモデルはHIV-1に感染することができ、ウイルス複製はcARTレジメンで制御することができる。さらに、cARTの中断は、ヒト化マウスにおいて迅速なウイルスリバウンドをもたらす。しかし、動物へのcARTの投与は効果がないか、困難であるか、または有毒である可能性があり、多くの臨床的に関連するcARTレジメンを最適に利用することはできません。研究者にとって潜在的に安全ではないことに加えて、一般的に使用される集中的な毎日の注射手順によるcARTの投与は、動物の身体的拘束によってストレスを誘発します。この記事に記載されているHIV-1感染ヒト化マウスを治療するための新しい経口cART法は、HIV-1感染ヒト化マウスの検出レベルを下回るウイルス血症の抑制、CD4+回復率の増加、および全体的な健康状態の改善をもたらしました。

体重25gの平均的なマウスが1日あたり4gの食物を消費すると仮定すると、経口摂取による1日の薬物投与量は、2.88mg / kg TFV、83mg / kg FTC、および768mg / kgRALに相当します。最適化された食物レジメンが毒性であり、cARTの毎日の注射と比較して全体的な健康に影響を与えるかどうかをテストするために、マウスの体重を経口または皮下注射によるcARTの前と最中に毎週監視しました。各群において、cA...

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Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

このプロトコルは、ヒト化マウスにおけるHIV-1 RNA複製を首尾よく抑制する経口併用抗レトロウイルス薬を送達するための新しい方法を説明しています。

HIV-1感染ヒト化マウスにおける経口併用抗レトロウイルス治療

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

このプロトコルは、ヒト化マウスにおけるHIV RNA複製を首尾よく抑制する経口併用抗レトロウイルス薬(ART)を送達するための新しい方法を説明しています。新しい経口ART法は、その安全性、調製と投与の容易さ、および毎日の注射に起因する動物のストレスの軽減により、以前の送達の試みを上回っています。ヒト化マウスにおけるHIV RNA複製を抑制するために提案された経口送達法は、慢性HIV感染者の薬物送達を厳密に模倣する新しい治療法を開発するための前臨床概念実証研究にとって非常に価値があります。手順を実演するのは、私たちの研究室のラボマネージャー兼技術者であるヴァレリーレザックです。個々の薬の重さを量ることから始めます。滅菌セルスクレーパーを使用してcARTで10個のフードカップを作成し、250ミリグラムのFTC、375ミリグラムのTDF、および500ミリグラムのRALまたはELVを、バイオセーフティキャビネット内の個々の滅菌50ミリリットルの遠心分離機チューブに計量します。DMSOをFTCおよびTDFチューブに追加してミリリットルあたり250ミリグラムの最終濃度にし、RALまたはELVチューブに500ミリリットルあたり500ミリグラムの最終濃度にします。透明な溶液が得られるまで攪拌およびピペッティングによって薬液を混合する。滅菌シリンジ付きの0.22マイクロメートルの親水性PVDFメンブレンフィルターを使用して溶液を滅菌します。個々の薬液は、摂氏マイナス20度で12週間保存できます。使用前に各薬液のアリコート1個を、溶液が透明になるまで摂氏37度で新たに解凍します。ピペットを使ってよく混ぜます。DMSOに溶解した薬剤を混ぜ合わせてよく混ぜ合わせ、FTC1ミリリットル、TDF1.5ミリリットル、ELVまたはRAL1ミリリットルを含むマスターミックスを作ります。350マイクロリットルのcARTマスターミックス溶液をカップに加えて、1つのダイエットジェルブーストcARTカップを準備します。0.75ミリリットルのトリメトプリムスルファメトキサソールをカップに加えます。1ミリリットルの滅菌ピペットチップを使用して十分に攪拌します。ピペットチップを使用して、cARTを含むフードカップを60ミリメートルのペトリ皿に分注します。マウスの数に応じてケージごとに餌を量ることにより、フードカップ内のcARTの量を計算します。ケージから通常のチャウチャウを取り出し、cARTを含むフードカップと交換します。週に3回cART食品を更新します。使用済みのカップの重量を量って摂取量を監視します。次に、マウスの体重を毎週測定して消費量を確認します。HIV-1感染の4週間後、マウスは、皮下注射によるFTC / TDF / RALレジメン、またはFTC / TDF / RALまたはFTC / TDF / ELVの経口投与のいずれかで、さらに7.5週間治療されました。マウスの体重は、毎日のcART皮下注射中に継続的に減少しました。対照的に、ダイエットジェルは、経口cART投与の5週間後にマウスの体重をART開始前のレベルに回復させました。さらに、RALまたはELVグループ間で有意な体重変化は観察されませんでした。4週間以内に、FTC / TDF / ELVおよびRAL/ART食品レジメンは、ウイルス複製をそれぞれ100%および80%抑制した。SC注射を受けたマウスの70%は、4週間の治療後に検出できないレベルに達しました。.その結果、経口投与は皮下注射よりも迅速かつ効率的にウイルス複製を抑制することが確認された。さらに、cARTの食事療法は、毎日の注射よりも早く末梢血中のCD4とCD8の比率のさらなる低下を防ぎました。プロセス全体を通してプロトコルに関与する材料の無菌性を維持し、cARTストック溶液の複数回の凍結と解凍を回避することが重要です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...