Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
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우리는 이 연구에 사용된 항레트로바이러스 약물을 제공해 주신 로마스 겔레지우나스 박사와 제프 머리 박사 그리고 길르앗 사람들에게 감사드리고 싶습니다. 이 연구는 NCI 1R01CA239261-01 (Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core, and Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs : Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (Zhen에게), NIAID R2120200174 (PIs : Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). 이 작업은 UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust 및 McCarthy Family Foundation의 지원도 받았습니다.

익명화된 인간 태아 조직은 상업적으로 획득되었다. 동물 연구는 모든 연방, 주 및 지역 지침에 따라 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스 및 (UCLA) 동물 연구 위원회(ARC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 구체적으로, 모든 실험은 UCLA ARC 프로토콜 번호 2010-038-02B에 따라 국립 보건원 (NIH) 및 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AALAC) 국제 실험실 동물의 주거 및 관리에 대한 권장 사항...

경구 cART 투여 방법은 HIV-1에 감염된 인간화 마우스를 위해 고 영양 식품 내에 3 가지 항 레트로 바이러스 약물을 결합하여 개발되었습니다. 매일 주사에 의한 투여에 비해 경구 전달은 사용하기 쉽고, 투여 빈도를 제한하고, 동물 취급을 줄이고, 스트레스를 최소화하고, 안전성을 향상시킵니다55. 이 시점까지, 인간화 마우스 24,37,41에 대한 소수의 연구만이 마우스를 치료하기 위?...

만성 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 감염된 개인의 기대 수명은 조합 항레트로바이러스 치료(cART)로 크게 향상되었습니다1,2. cART는 HIV-1 복제를 성공적으로 감소시키고 대부분의 HIV-1 만성감염 참가자3에서 CD4+ T 세포 수를 정상으로 증가시켜 전반적인 건강을 개선하고 질병진행을 극적으로 감소시킵니다4. 그러나 잠복 HIV-1 저장소는 급성 감염 5,6,7 동안 ART가 시작된 경우에도 설정됩니다. 저장소는 ART 동안 수년에 걸쳐 지속되며 ART 중단 후 빠른 바이러스 반동은 잘 문서화되어 있습니다 8,9. ART에서 HIV에 감염된 사람들은 또한 심혈관 질환, 암 및 신경 장애와 같은 동반 질환의 위험이 더 높기 쉽습니다10,11,12. 따라서 HIV에 대한 기능적 치료가 필요합니다. HIV-1 감염에 대한 동물 모델은 새로운 HIV 치료 전략13,14,15를 개발하고 검증하는 데 명백한 이점을 제공합니다. 인간화 마우스는 작은 동물 모델로서 다른 조직에서 다계통 인간 면역 세포 재구성을 제공할 수 있으며, 이는 HIV 감염16,17,18,19에 대한 면밀한 연구를 가능하게 합니다. 인간화 모델 중에서, 인간화 골수-간-흉선 (BLT) 모델은 HIV-1 감염에 대한 기능적 인간 면역 반응뿐만 아니라 만성 HIV-1 감염을 성공적으로 요약한다 20,21,22,23,24. 따라서, 인간화 BLT 마우스 모델은 HIV 연구 분야에서 다양한 측면을 조사하는데 널리 이용되고 있다. 인간화 BLT 마우스는 지속적인 HIV-1 감염 및 병인의 요약을 위한 잘 확립된 모델일 뿐만 아니라 세포 치료 기반 개입 전략의 평가를 위한 결과적 도구이기도 합니다. 현재의 저자 및 다른 사람들은 인간화 BLT 마우스 모델이 지속적인 HIV-1 감염 및 병인25,26,27을 요약하고 세포 치료 기반 중재 전략 28,29,30,31,32,33을 평가하는 도구를 제공한다는 것을 입증했습니다.
매일 복용하는 항 레트로 바이러스 약물의 조합으로 구성된 cART 요법은 성공적으로 치료 된 개인의 바이러스 부하가 장기간 동안 검출 할 수없는 지점까지 HIV-1 복제를 억제합니다34. 임상적으로 관련된 cART 요법으로 HIV-감염된 인간화 마우스를 치료하는 결과는 HIV-1에 감염된 ART-치료된 개체에서 관찰된 것과 유사하다22: HIV-1 수준은 검출의 한계 이하로 억제되고, cART의 중단은 잠복 저장소(35)로부터 HIV 복제의 반동을 초래한다. 피하 (SC) 27,36,37 또는 복강 내 (IP) 37,38,39 주사는 인간화 마우스에서 cART 치료에 일반적으로 사용되는 경로입니다. 그러나, 집중적인 일일 주사는 신체적 구속에 의해 동물에게 스트레스를 유도한다(40). 또한 노동 집약적이며 날카로운 물건을 사용하는 동안 HIV에 대한 노출이 증가하기 때문에 연구자에게 잠재적으로 안전하지 않습니다. 경구 투여는 HIV-1에 감염된 개인이 복용하는 cART 약물의 흡수, 분포 및 배설을 모방하는 데 이상적입니다. 경구 투여는 일반적으로 항 레트로 바이러스 약물을 멸균 된 (마우스의 면역 결핍으로 인해 필요함) 음식 24,37,41 또는 물42,43,44,45,46에 넣는 맞춤형 및 종종 힘든 절차를 포함합니다. , 이는 많은 항 레트로 바이러스 약물과 화학적으로 양립 할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있고, 마우스가 쉽게 먹거나 마시지 않는 것을 초래할 수도 있습니다 (신체의 복용량 및 약물 수준에 영향을 미칠 수 있음). 여기에 제안된 새로운 peroral cART 투여 방법은 다양한 유형의 항레트로바이러스 약물과의 호환성, 안전성 및 준비 및 투여 용이성, 매일 주사로 인한 동물 스트레스 및 불안 감소로 인해 이전 전달 시도를 능가합니다.
Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) 및 Raltegravir (RAL)는 수용성이 낮은 약물입니다. 흥미롭게도, TDF의 증가된 생체이용률은 지방 식품에서 관찰되며, 이는 지방이 많은 음식에 의한 리파아제의 경쟁적 억제가 TDF47에 대한 특정 보호를 제공할 수 있음을 시사한다. 따라서 DietGel Boost 컵은 일반 설치류 차우(100g당 10g) 및 일반적인 마우스 고지방 식단(100g당 40-60g)48과 비교하여 적당한 지방 함량(100g당 20.3g)을 기반으로 전달 방법으로 일반 설치류 차우를 대체하기 위해 선택되었습니다. 한 컵의 총 무게는 75g입니다. 따라서 각 컵에는 3 일 동안 5 마리의 마우스에 충분한 양의 음식과 약물이 들어 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

인간 면역 결핍 바이러스(HIV-1) 대유행은 전 세계적으로 계속 확산되고 있으며 현재 HIV에 대한 백신은 없습니다. 조합 항 레트로 바이러스 요법 (cART)이 바이러스 복제를 억제하는 데 성공했지만 HIV에 감염된 개체로부터 저장소를 완전히 근절 할 수는 없습니다. HIV 감염에 대한 안전하고 효과적인 치료 전략에는 다각적 인 방법이 필요하므로 HIV-1 감염에 대한 동물 모델의 발전은 HIV 치료 연구의 발전에 중추적입니다. 인간화 마우스는 HIV-1 감염의 주요 특징을 요약합니다. 인간화 마우스 모델은 HIV-1에 의해 감염 될 수 있고 바이러스 복제는 cART 요법으로 제어 될 수있다. 더욱이, cART 중단은 인간화 마우스에서 즉각적인 바이러스 반동을 초래한다. 그러나, 동물에 대한 cART의 투여는 비효과적이거나, 어렵거나, 또는 독성일 수 있고, 많은 임상적으로 관련된 cART 요법이 최적으로 활용될 수 없다. 연구자에게 잠재적으로 안전하지 않은 것과 함께 일반적으로 사용되는 집중적 인 일일 주사 절차에 의한 cART의 투여는 동물의 신체적 구속에 의한 스트레스를 유도합니다. 이 기사에 설명된 HIV-1에 감염된 인간화 마우스를 치료하는 새로운 경구 cART 방법은 HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 검출 수준 미만의 바이러스혈증 억제, CD4+ 회복 속도 증가 및 전반적인 건강 개선을 가져왔습니다.

체중이 25g인 평균 마우스가 하루에 4g의 음식을 섭취한다고 가정하면 경구 섭취를 통한 일일 약물 용량은 2.88mg/kg TFV, 83mg/kg FTC 및 768mg/kg RAL에 해당합니다. 최적화된 식품 요법이 독성이 있고 cART의 일일 주사와 비교하여 전반적인 건강에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, 마우스 체중을 경구 또는 피하 주사를 통해 cART 전과 도중에 매주 모니터링하였다. 각 군에서 cART 투여 전에 유의한 체?...

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Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

이 프로토콜은 인간화 마우스에서 HIV-1 RNA 복제를 성공적으로 억제하는 경구 조합 항레트로바이러스 약물을 전달하는 새로운 방법을 설명합니다.

HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 경구 조합 항레트로바이러스 치료

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

이 프로토콜은 인간화 마우스에서 HIV RNA 복제를 성공적으로 억제하는 경구 조합 항레트로바이러스 약물 또는 ART를 전달하는 새로운 방법을 설명합니다. 새로운 경구 ART 방법은 안전성, 준비 및 투여의 용이성, 일일 주사로 인한 동물 스트레스 감소로 인해 이전 전달 시도를 능가합니다. 인간화 마우스에서 HIV RNA 복제를 억제하기 위해 제안된 경구 전달 방법은 만성 HIV 감염 개인의 약물 전달을 밀접하게 모방하는 새로운 치료 치료법을 개발하기 위한 전임상 개념 증명 연구에 매우 유용할 것입니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 실험실 관리자이자 기술자 인 Valerie Rezak입니다. 개별 약물의 무게를 측정하는 것으로 시작하십시오. 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 cART로 식품 컵 10개를 만들어 FTC 250mg, TDF 375mg, RAL 또는 ELV 500mg을 바이오 안전 캐비닛의 개별 멸균 50밀리리터 원심분리 튜브에 넣습니다.DMSO를 FTC 및 TDF 튜브에 추가하여 밀리리터당 250밀리그램의 최종 농도를 구성하고 RAL 또는 ELV 튜브에 밀리리터당 500밀리그램의 최종 농도를 구성합니다. 투명한 용액이 얻어질 때까지 교반하고 피펫팅하여 약물 용액을 혼합합니다. 멸균 주사기가있는 0.22 마이크로 미터 친수성 PVDF 멤브레인 필터를 사용하여 용액을 멸균하십시오.개별 약물 용액은 섭씨 영하 20도에서 12 주 동안 보관할 수 있습니다. 용액이 투명해질 때까지 섭씨 37도에서 사용하기 전에 각 약물 용액의 분취량 하나를 갓 해동하십시오. 피펫을 사용하여 잘 섞는다.DMSO에 용해 된 약물을 결합하고 잘 혼합하여 1 밀리리터의 FTC, 1.5 밀리리터의 TDF 및 1 밀리리터의 ELV 또는 RAL을 포함하는 마스터 믹스를 구성합니다. 350 마이크로 리터의 cART 마스터 믹스 용액을 컵에 넣고 하나의 다이어트 젤 부스트 cART 컵을 준비합니다. 컵에 0.75 밀리리터의 트리 메토 프림 설파 메 톡사 솔을 첨가하십시오.1 밀리리터 멸균 피펫 팁을 사용하여 철저히 저어줍니다. 피펫 팁을 사용하여 cART가 들어있는 식품 컵을 60mm 페트리 접시에 분취합니다. 마우스의 수에 따라 각 케이지에 대한 음식의 무게를 측정하여 음식 컵의 cART의 양을 계산하십시오.케이지에서 일반 차우를 제거하고 cART가 들어있는 식품 컵으로 교체하십시오. 일주일에 세 번 cART 음식을 새로 고칩니다. 섭취량을 모니터링하기 위해 사용한 컵의 무게를 측정합니다.그런 다음 매주 마우스의 무게를 측정하여 소비량을 확인합니다. HIV-1 감염 4주 후, 마우스는 피하 주사를 통한 FTC/TDF/RAL 요법 또는 FTC/TDF/RAL 또는 FTC/TDF/ELV의 경구 투여에 의해 7.5주 동안 추가로 치료되었습니다. 마우스 체중은 매일 cART 피하 주사 동안 지속적으로 감소하였다.대조적으로, 다이어트 젤은 경구 cART 투여 5주 후에 마우스 체중을 사전 ART 개시 수준으로 회복시켰다. 또한, RAL 또는 ELV 그룹 간에 유의한 체중 변화는 관찰되지 않았다. 4주 이내에 FTC/TDF/ELV 및 RAL/ART 식품 요법은 바이러스 복제를 각각 100% 및 80% 억제했습니다.SC 주사를 맞은 쥐의 70%가 치료 4주 후 감지할 수 없는 수준에 도달했습니다. 그 결과 경구 투여가 피하 주사보다 바이러스 복제를 더 빠르고 효율적으로 억제한다는 것을 확인했습니다. 또한, cART 식품 요법은 매일 주사보다 일찍 말초 혈액에서 CD4 대 CD8 비율의 추가 감소를 방지했습니다.전체 공정 동안 프로토콜과 관련된 모든 물질의 무균성을 유지하고 cART 스톡 용액의 다중 동결 및 해동을 방지하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

연구

면역학 및 감염병학

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

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Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...