Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Romas Geleziunas og Jeff Murry og folket på Gilead for å gi de antiretrovirale legemidlene som brukes i denne studien. Dette arbeidet ble finansiert av NCI 1R01CA239261-01 (til Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core og Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (til Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Dette arbeidet ble også støttet av UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust og McCarthy Family Foundation.

Anonymisert humant fostervev ble ervervet kommersielt. Dyreforsøk ble utført i henhold til protokoller godkjent av University of California, Los Angeles og (UCLA) Animal Research Committee (ARC) i samsvar med alle føderale, statlige og lokale retningslinjer. Spesielt ble alle forsøkene utført i samsvar med anbefalingene og retningslinjene for bolig og stell av laboratoriedyr fra National Institutes of Health (NIH) og Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International under U...

En oral cART-administrasjonsmetode er utviklet her for HIV-1-infiserte humaniserte mus ved å kombinere tre antiretrovirale legemidler innen næringsrik mat. Sammenlignet med administrasjon ved daglige injeksjoner, er oral levering enklere å bruke, begrenser administrasjonsfrekvensen, reduserer dyrehåndtering, minimerer stress og forbedrer sikkerheten55. Frem til dette punktet har bare noen få studier på humaniserte mus 24,37,41 brukt matpellets som inneholder knuste ART-stoffer for å behandl...

Forventet levetid for kronisk humant immunsviktvirus (HIV)-infiserte individer er betydelig forbedret med kombinasjons-antiretroviral behandling (cART)1,2. cART reduserer vellykket HIV-1-replikasjonen og øker CD4 + T-celletallet til normalitet hos flertallet av HIV-1 kronisk infiserte deltakere3, noe som resulterer i forbedret generell helse og dramatisk redusert sykdomsprogresjon4. Det latente HIV-1-reservoaret etableres imidlertid selv når ART initieres ved akutt infeksjon 5,6,7. Reservoarer vedvarer over år under ART og rask viral rebound etter ART-avbrudd er godt dokumentert 8,9. Personer som lever med HIV på ART er også disponert for en høyere risiko for comorbiditeter som kardiovaskulær sykdom, kreft og nevroforstyrrelser10,11,12. Derfor er det nødvendig med en funksjonell kur for HIV. Dyremodeller for HIV-1-infeksjon gir åpenbare fordeler ved å utvikle og validere nye HIV-kurstrategier13,14,15. Humaniserte mus, som en liten dyremodell, kan gi multilineage human immuncelle rekonstituering i forskjellige vev, noe som gjør det mulig å studere HIV-infeksjon16,17,18,19. Blant humaniserte modeller rekapitulerer den humaniserte benmarg-lever-tymus (BLT) -modellen vellykket kronisk HIV-1-infeksjon samt funksjonelle humane immunresponser mot HIV-1-infeksjon 20,21,22,23,24. Derfor har den humaniserte BLT-musemodellen blitt mye brukt til å undersøke ulike aspekter i HIV-forskningsfeltet. Humaniserte BLT-mus er ikke bare veletablerte modeller for rekapitulering av vedvarende HIV-1-infeksjon og patogenese, men også konsekvensverktøy for evaluering av celleterapibaserte intervensjonsstrategier. De nåværende forfatterne og andre har vist at den humaniserte BLT-musemodellen rekapitulerer vedvarende HIV-1-infeksjon og patogenese 25,26,27 og gir verktøy for å evaluere celleterapibaserte intervensjonsstrategier 28,29,30,31,32,33. 
cART-regimer som består av kombinasjoner av antiretrovirale legemidler som tas daglig, undertrykker HIV-1-replikasjon til det punktet at virusbelastningen hos vellykkede behandlede individer forblir uoppdagelig på lang sikt34. Resultatene av behandling av HIV-infiserte humaniserte mus med klinisk relevante cART-regimer ligner de som er observert hos HIV-1-infiserte ART-behandlede individer22: HIV-1-nivåer undertrykkes under grensene for deteksjon og avbrudd av cART-resultater i en rebound av HIV-replikasjon fra det latente reservoaret35. Subkutan (SC)27,36,37 eller intraperitoneal (IP)37,38,39 injeksjon er ruten som vanligvis brukes til cART-behandling hos humaniserte mus. Imidlertid induserer intensiv daglig injeksjon stress til dyr ved fysisk tilbakeholdenhet40. Det er også arbeidskrevende og potensielt usikkert for forskere på grunn av økt eksponering for HIV mens du bruker skarpe stoffer. Oral administrering er ideell for å etterligne absorpsjon, distribusjon og utskillelse av cART-legemidler som tas av HIV-1-infiserte personer. Oral administrering innebærer vanligvis tilpassede og ofte arbeidskrevende prosedyrer for å sette de antiretrovirale legemidlene i sterilisert (nødvendig på grunn av immundefekt hos musene) mat 24,37,41 eller vann 42,43,44,45,46 , som kan eller ikke kan være kjemisk kompatibel med mange antiretrovirale legemidler, eller resultere i noe musene ikke lett vil spise eller drikke (noe som vil påvirke dose og legemiddelnivåer i kroppen). Den nye perorale cART-administrasjonsmetoden som foreslås her, overgår tidligere leveringsforsøk på grunn av dens kompatibilitet med forskjellige typer antiretrovirale legemidler, sikkerhet og enkel forberedelse og administrasjon, og reduksjon av dyrs stress og angst som følge av den daglige injeksjonen.
Tenofovirdisoproksilfumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) og Raltegravir (RAL) er dårlig vannløselige legemidler. Interessant nok observeres økt biotilgjengelighet av TDF med fettstoffer, noe som tyder på at konkurransedyktig inhibering av lipaser av fet mat kan gi viss beskyttelse for TDF47. Derfor ble DietGel Boost-kopper valgt for å erstatte vanlig gnager chow som leveringsmetode basert på deres beskjedne fettinnhold (20,3 g per 100 g) sammenlignet med vanlig gnager chow (10 g per 100 g) og et typisk mus fettfattig kosthold (40-60 g per 100 g) 48. Den totale vekten av en kopp er 75 g; Dermed vil hver kopp inneholde mengden mat, og derfor stoff, tilstrekkelig for fem mus over 3 dager.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

Humant immunsviktvirus (HIV-1) -pandemien fortsetter å spre seg med uforminsket styrke over hele verden, og for tiden er det ingen vaksine tilgjengelig mot HIV. Selv om kombinert antiretroviral terapi (cART) har vært vellykket i å undertrykke viral replikasjon, kan det ikke helt utrydde reservoaret fra HIV-infiserte individer. En sikker og effektiv kurstrategi for HIV-infeksjon vil kreve multipronged metoder, og derfor er fremskrittene av dyremodeller for HIV-1-infeksjon avgjørende for utviklingen av HIV-kurforskning. Humaniserte mus rekapitulerer viktige trekk ved HIV-1-infeksjon. Den humaniserte musemodellen kan infiseres av HIV-1 og viral replikasjon kan kontrolleres med cART-regimer. Videre resulterer cART-avbrudd i en rask viral rebound hos humaniserte mus. Administrering av cART til dyret kan imidlertid være ineffektivt, vanskelig eller giftig, og mange klinisk relevante cART-regimer kan ikke utnyttes optimalt. Sammen med å være potensielt usikre for forskere, induserer administrering av cART ved en vanlig intensiv daglig injeksjonsprosedyre stress ved fysisk begrensning av dyret. Den nye orale cART-metoden for å behandle HIV-1-infiserte humaniserte mus beskrevet i denne artikkelen resulterte i undertrykkelse av viremi under deteksjonsnivået, økt grad av CD4 + restaurering og forbedret generell helse hos HIV-1-infiserte humaniserte mus.

Forutsatt at en gjennomsnittlig mus som veier 25 g bruker 4 g mat per dag, tilsvarer den daglige legemiddeldosen gjennom oral inntak 2,88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC og 768 mg / kg RAL. For å teste om det optimaliserte matregimet er giftig og påvirker den generelle helsen sammenlignet med daglig injeksjon av cART, ble musens vekt overvåket ukentlig før og under cART gjennom oral eller subkutan injeksjon. Det var ingen signifikante vektforskjeller før administrering av cART i hver gruppe (figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Denne protokollen beskriver en ny metode for å levere orale kombinasjons-antiretrovirale legemidler som vellykket undertrykker HIV-1 RNA-replikasjon hos humaniserte mus.

Oral kombinasjons antiretroviral behandling i HIV-1-infiserte humaniserte mus

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Denne protokollen beskriver en ny metode for å levere orale kombinasjonsantiretrovirale legemidler, eller ART, som vellykket undertrykker HIV RNA-replikasjon hos humaniserte mus. Den nye orale ART-metoden overgår tidligere leveringsforsøk på grunn av sikkerheten, enkel forberedelse og administrasjon, og redusert dyrestress som følge av en daglig injeksjon. Den foreslåtte orale leveringsmetoden for å undertrykke HIV RNA-replikasjon hos humaniserte mus vil være svært verdifull for prekliniske proof-of-concept-studier for å utvikle nye kurbehandlinger som nøye etterligner legemiddelleveransen hos kroniske HIV-infiserte individer.Demonstrere prosedyren vil være Valerie Rezak, en lab manager og tekniker fra vårt laboratorium. Begynn med å veie individuelle stoffer. Lag 10 matkopper med cART ved hjelp av sterile celleskraper for å veie ut 250 milligram FTC, 375 milligram TDF og 500 milligram RAL eller ELV i individuelle, sterile 50 milliliter sentrifugerør i et biosikkerhetsskap.Legg DMSO til FTC- og TDF-røret for å utgjøre en endelig konsentrasjon på 250 milligram per milliliter, og inn i RAL- eller ELV-røret til en endelig konsentrasjon på 500 milligram per milliliter. Bland stoffoppløsningen ved omrøring og pipettering til en klar løsning er oppnådd. Steriliser løsningene ved hjelp av et 0,22 mikrometer hydrofilt PVDF-membranfilter med en steril sprøyte.Individuelle legemiddelløsninger kan lagres ved minus 20 grader Celsius i 12 uker. Tine en aliquot av hver legemiddeloppløsning før bruk ved 37 grader Celsius til løsningen blir klar. Bland godt med en pipette.Kombiner stoffene oppløst i DMSO og bland godt for å lage en hovedblanding som inneholder en milliliter FTC, 1, 5 milliliter TDF og en milliliter ELV eller RAL. Tilsett 350 mikroliter cART masterblandingsløsning i en kopp for å forberede en diettgelforsterkning cART-kopp. Tilsett 0,75 ml trimetoprimsulfametoksasol i koppen.Rør grundig med en milliliter sterile pipettespisser. Bruk en pipettespiss til å aliquot matkoppen som inneholder cART på en 60 millimeter petriskål. Beregn mengden cART i matkoppen ved å veie maten for hvert bur i henhold til antall mus.Fjern vanlig chow fra buret og erstatt den med en matkopp som inneholder cART. Oppdater cART-mat tre ganger per uke. Vei brukte kopper for å overvåke inntaket.Vei deretter musene ukentlig for å bekrefte forbruket. Etter fire uker med HIV-1-infeksjon ble mus behandlet i ytterligere 7,5 uker, enten med FTC / TDF / RAL-regime gjennom subkutan injeksjon eller ved oral administrering av FTC / TDF / RAL eller FTC / TDF / ELV. Musevekten ble kontinuerlig redusert under daglig cART subkutan injeksjon.I motsetning til dette gjenopprettet diettgel musevekter til pre-ART-initieringsnivåer etter fem uker med oral cART-administrasjon. I tillegg ble det ikke observert signifikante vektendringer mellom RAL- eller ELV-gruppene. Innen fire uker undertrykte FTC / TDF / ELV og RAL / ART matregimet viral replikasjon med henholdsvis 100% og 80%.70% av musene som fikk SC-injeksjon nådde uoppdagelige nivåer etter fire ukers behandling. Resultatene bekreftet at oral administrasjon undertrykte viral replikasjon raskere og mer effektivt enn subkutane injeksjoner. Videre forhindret cART-matregimet den ytterligere nedgangen i forholdet mellom CD4 og CD8 i perifert blod tidligere enn daglige injeksjoner.Det er avgjørende å opprettholde steriliteten til ethvert materiale som er involvert i protokollen under hele prosessen og unngå flere frysing og tining av cART-stamløsningen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging av HIV-1-konvolutt-indusert virologisk Synapse og signaliserer på Syntetiske Lipid bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nye verktøy for å utvide Regulatoriske T-celler fra HIV-1-infiserte individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdere Medfødt Sensing av HIV-1 infiserte CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved Plasmacytoid dendrittiske celler ved hjelp av en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Evaluering av HIV-1 Trimeric kappeglykoproteiner Ved hjelp av en Cell-basert ELISA-analysen

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av Exosomes fra Plasma av HIV-1 Positive Personer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...