Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
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Gostaríamos de agradecer aos Drs. Romas Geleziunas e Jeff Murry e ao pessoal da Gilead por fornecerem os medicamentos antirretrovirais utilizados neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo NCI 1R01CA239261-01 (to Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core e Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (para Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Este trabalho também foi apoiado pelo UCLA AIDS Institute, o James B. Pendleton Charitable Trust e a McCarthy Family Foundation.

O tecido fetal humano anonimizado foi adquirido comercialmente. A pesquisa em animais foi realizada de acordo com protocolos aprovados pela Universidade da Califórnia, Los Angeles, e pelo Comitê de Pesquisa Animal (ARC) (UCLA), de acordo com todas as diretrizes federais, estaduais e locais. Especificamente, todos os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações e diretrizes para alojamento e cuidado de animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e da Associação para a Avaliação...

Um método de administração oral de cART é desenvolvido aqui para camundongos humanizados infectados pelo HIV-1, combinando três medicamentos antirretrovirais em alimentos ricos em nutrientes. Em comparação com a administração por injeções diárias, o parto oral é mais fácil de usar, limita a frequência de administração, reduz o manuseio dos animais, minimiza o estresse e melhora a segurança55. Até este ponto, apenas alguns estudos em camundongos humanizados 24,37,41<su...

A expectativa de vida de indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana crônica (HIV) melhorou significativamente com o tratamento antirretroviral combinatório (cTARV)1,2. A cTARV reduz com sucesso a replicação do HIV-1 e aumenta a contagem de células T CD4+ para a normalidade na maioria dos participantes cronicamente infectados pelo HIV-13, resultando em melhora da saúde geral e redução drástica da progressão da doença4. No entanto, o reservatório latente do HIV-1 é estabelecido mesmo quando a TARV é iniciada durante a infecção aguda 5,6,7. Os reservatórios persistem ao longo dos anos durante a TARV e o rápido rebote viral após a interrupção da TARV está bem documentado 8,9. Pessoas vivendo com HIV em TARV também estão predispostas a um maior risco de comorbidades como doenças cardiovasculares, câncer e distúrbios neurológicos10,11,12. Portanto, uma cura funcional para o HIV é necessária. Modelos animais para a infecção pelo HIV-1 oferecem vantagens óbvias no desenvolvimento e validação de novas estratégias de cura do HIV13,14,15. Camundongos humanizados, como modelo animal de pequeno porte, podem proporcionar reconstituição de células imunes humanas multilinhagem em diferentes tecidos, o que permite o estudo minucioso da infecção pelo HIV16,17,18,19. Dentre os modelos humanizados, o modelo humanizado de medula óssea-fígado-timo (BLT) recapitula com sucesso a infecção crônica pelo HIV-1, bem como as respostas imunes humanas funcionais à infecção pelo HIV-1 20,21,22,23,24. Portanto, o modelo humanizado de camundongo BLT tem sido amplamente utilizado para investigar diversos aspectos no campo da pesquisa sobre HIV. Camundongos BLT humanizados não são apenas modelos bem estabelecidos para a recapitulação da infecção persistente pelo HIV-1 e patogênese, mas também ferramentas consequentes para a avaliação de estratégias de intervenção baseadas em terapia celular. Os autores atuais e outros demonstraram que o modelo humanizado de camundongos BLT recapitula a infecção persistente pelo HIV-1 e a patogênese 25,26,27 e fornece ferramentas para avaliar estratégias de intervenção baseadas em terapia celular 28,29,30,31,32,33 .
Os esquemas de cTARV que consistem em combinações de medicamentos antirretrovirais que são tomados diariamente suprimem a replicação do HIV-1 a ponto de a carga viral em indivíduos tratados com sucesso permanecer indetectável a longo prazo34. Os resultados do tratamento de camundongos humanizados infectados pelo HIV com regimes de TARV clinicamente relevantes assemelham-se aos observados em indivíduos infectados pelo HIV-1 tratados com TARV22: os níveis de HIV-1 são suprimidos abaixo dos limites de detecção e interrupção dos resultados da cART em um rebote da replicação do HIV do reservatório latente35. A injeção subcutânea (SC)27,36,37 ou intraperitoneal (IP)37,38,39 é a via comumente utilizada para o tratamento da cART em camundongos humanizados. No entanto, a injeção diária intensiva induz estresse aos animais pela contenção física40. Também é trabalhoso e potencialmente inseguro para os pesquisadores devido ao aumento da exposição ao HIV durante o uso de objetos cortantes. A administração oral é ideal para imitar a absorção, distribuição e excreção de medicamentos cART que são tomados por indivíduos infectados pelo HIV-1. A administração oral geralmente envolve procedimentos personalizados e muitas vezes trabalhosos para colocar os medicamentos antirretrovirais em alimentos esterilizados (necessários devido à imunodeficiência dos camundongos) 24,37,41 ou água 42,43,44,45,46 , que pode ou não ser quimicamente compatível com muitos medicamentos antirretrovirais, ou resultar em algo que os ratos não comeriam ou beberiam prontamente (o que afetaria a dose e os níveis de drogas no corpo). O novo método de administração de cART peroral proposto aqui supera as tentativas de parto anteriores devido à sua compatibilidade com diferentes tipos de medicamentos antirretrovirais, segurança e facilidade de preparação e administração, e redução do estresse e ansiedade animal resultantes da injeção diária.
Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) e Raltegravir (RAL) são drogas pouco solúveis em água. Curiosamente, o aumento da biodisponibilidade do TDF é observado com alimentos gordurosos, sugerindo que a inibição competitiva das lipases por alimentos gordurosos pode fornecer certa proteção para o TDF47. Portanto, os copos DietGel Boost foram selecionados para substituir a ração regular de roedores como método de entrega com base em seu modesto teor de gordura (20,3 g por 100 g) em comparação com a ração regular de roedores (10 g por 100 g) e uma dieta típica rica em gordura de camundongo (40-60 g por 100 g)48. O peso total de um copo é de 75 g; assim, cada xícara conterá a quantidade de alimento e, portanto, droga, suficiente para cinco ratos ao longo de 3 dias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

A pandemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) continua a se espalhar incessantemente em todo o mundo e, atualmente, não há vacina disponível contra o HIV. Embora a terapia antirretroviral combinacional (cTARV) tenha sido bem-sucedida na supressão da replicação viral, ela não pode erradicar completamente o reservatório de indivíduos infectados pelo HIV. Uma estratégia de cura segura e eficaz para a infecção pelo HIV exigirá métodos multifacetados e, portanto, os avanços dos modelos animais para a infecção pelo HIV-1 são fundamentais para o desenvolvimento da pesquisa de cura do HIV. Camundongos humanizados recapitulam as principais características da infecção pelo HIV-1. O modelo de camundongo humanizado pode ser infectado pelo HIV-1 e a replicação viral pode ser controlada com regimes de cTARV. Além disso, a interrupção da cART resulta em um rápido rebote viral em camundongos humanizados. No entanto, a administração de cART ao animal pode ser ineficaz, difícil ou tóxica, e muitos regimes de cART clinicamente relevantes não podem ser utilizados de forma ideal. Além de ser potencialmente insegura para os pesquisadores, a administração de cART por um procedimento de injeção diária intensiva comumente usado induz o estresse pela contenção física do animal. O novo método de cART oral para tratar camundongos humanizados infectados pelo HIV-1 descrito neste artigo resultou na supressão da viremia abaixo do nível de detecção, aumento da taxa de restauração CD4+ e melhoria da saúde geral em camundongos humanizados infectados pelo HIV-1.

Supondo que um rato médio pesando 25 g consuma 4 g de alimento por dia, a dose diária do medicamento através da ingestão oral corresponde a 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC e 768 mg/kg RAL. Para testar se o regime alimentar otimizado é tóxico e influencia a saúde geral em comparação com a injeção diária de cART, o peso dos ratos foi monitorado semanalmente antes e durante a cART através de injeção oral ou subcutânea. Não houve diferenças significativas de peso antes da administração da TARV em cada grupo ...

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Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais combinacionais orais que suprimem com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados.

Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais de combinação oral, ou TARV, que suprime com sucesso a replicação do RNA do HIV em camundongos humanizados. O novo método de TARV oral supera as tentativas de parto anteriores devido à sua segurança, facilidade de preparação e administração e redução do estresse animal resultante de uma injeção diária. O método de entrega oral proposto para suprimir a replicação do RNA do HIV em camundongos humanizados será altamente valioso para estudos pré-clínicos de prova de conceito para desenvolver novos tratamentos de cura que imitem de perto a administração de medicamentos em indivíduos crônicos infectados pelo HIV.Demonstrando o procedimento estará Valerie Rezak, gerente de laboratório e técnica do nosso laboratório. Comece pesando drogas individuais. Faça 10 copos de alimentos com cART usando raspadores de células estéreis para pesar 250 miligramas de FTC, 375 miligramas de TDF e 500 miligramas de RAL ou ELV em tubos de centrífuga individuais e estéreis de 50 mililitros em um gabinete de biossegurança.Adicionar DMSO ao tubo FTC e TDF para formar uma concentração final de 250 miligramas por mililitro, e no tubo RAL ou ELV a uma concentração final de 500 miligramas por mililitro. Misture a solução do medicamento agitando e pipetando até que uma solução clara seja obtida. Esterilizar as soluções utilizando um filtro de membrana de PVDF hidrofílico de 0,22 micrómetros com uma seringa estéril.Soluções medicamentosas individuais podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por 12 semanas. Descongele recentemente uma alíquota de cada solução medicamentosa antes do uso a 37 graus Celsius até que a solução fique clara. Misture bem usando uma pipeta.Combine os medicamentos dissolvidos em DMSO e misture bem para compor uma mistura mestra contendo um mililitro de FTC, 1,5 mililitros de TDF e um mililitro de ELV ou RAL. Adicione 350 microlitros de solução de mistura mestre cART em um copo para preparar um copo de gel diet boost cART. Adicione 0,75 mililitros de trimetoprim sulfametoxasol no copo.Mexa bem usando pontas de pipeta estéril de um mililitro. Usando uma ponta de pipeta, alíquota do copo de comida contendo cART em uma placa de Petri de 60 milímetros. Calcule a quantidade de cART no copo de comida pesando o alimento para cada gaiola de acordo com o número de camundongos.Remova a ração regular da gaiola e substitua-a por um copo de comida contendo cART. Atualize a comida cART três vezes por semana. Pesar copos usados para monitorar a ingestão.Em seguida, pese os ratos semanalmente para confirmar o consumo. Após quatro semanas de infecção pelo HIV-1, os camundongos foram tratados por mais 7,5 semanas, seja com o regime FTC/TDF/RAL por injeção subcutânea ou pela administração oral de FTC/TDF/RAL ou FTC/TDF/ELV. O peso do rato diminuiu continuamente durante a injeção subcutânea diária de cART.Em contraste, o gel dietético restaurou os pesos dos ratos aos níveis de iniciação pré-TARV após cinco semanas de administração oral de TARV. Além disso, não foram observadas alterações significativas de peso entre os grupos RAL ou ELV. Dentro de quatro semanas, o regime alimentar FTC/TDF/ELV e RAL/ART suprimiu a replicação viral em 100% e 80%, respectivamente.70% dos ratos que receberam injeção de SC atingiram níveis indetectáveis após quatro semanas de tratamento. Os resultados confirmaram que a administração oral suprimiu a replicação viral de forma mais rápida e eficiente do que as injeções subcutâneas. Além disso, o regime alimentar de cART impediu o declínio adicional das proporções de CD4 para CD8 no sangue periférico mais cedo do que as injeções diárias.É fundamental manter a esterilidade de qualquer material envolvido no protocolo durante todo o processo e evitar o congelamento e descongelamento múltiplos da solução de estoque de cART.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

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Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

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Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

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