Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить докторов Ромаса Гелезиунаса и Джеффа Марри, а также сотрудников Gilead за предоставление антиретровирусных препаратов, используемых в этом исследовании. Эта работа финансировалась NCI 1R01CA239261-01 (для кухни), грантами NIH P30AI28697 (ядро вирусологии UCLA CFAR, ядро генной и клеточной терапии и гуманизированное ядро мыши), U19AI149504 (PI: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (для Zhen), NIAID R2120200174 (PI: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Эта работа также была поддержана Институтом СПИДа UCLA, Благотворительным фондом Джеймса Б. Пендлтона и Фондом семьи Маккарти.

Анонимная ткань человеческого плода была приобретена коммерчески. Исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, одобренными Калифорнийским университетом в Лос-Анджелесе и Комитетом по исследованиям животных (ARC) (UCLA) в соответствии со всеми федеральными, государ?...

Здесь разработан метод перорального введения кАРТ для ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей путем объединения трех антиретровирусных препаратов в пище с высоким содержанием питательных веществ. По сравнению с введением ежедневными инъекциями, пероральные роды проще в использ?...

Ожидаемая продолжительность жизни лиц, инфицированных хроническим вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), значительно улучшилась при комбинированном антиретровирусном лечении (кАРТ)1,2. cART успешно снижает репликацию ВИЧ-1 и увеличивает количество CD4+ Т-клеток до нормального состояния у большинства ВИЧ-1 хронически инфицированных участников3, что приводит к улучшению общего состояния здоровья и резкому снижению прогрессирования заболевания4. Однако латентный резервуар ВИЧ-1 устанавливается даже тогда, когда АРТ инициируется во время острой инфекции 5,6,7. Резервуары сохраняются в течение многих лет во время АРТ, а быстрый вирусный отскок после прерывания АРТ хорошо документирован 8,9. Люди, живущие с ВИЧ на АРТ, также предрасположены к более высокому риску сопутствующих заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, рак и нервные расстройства 10,11,12. Поэтому необходимо функциональное лекарство от ВИЧ. Животные модели для инфекции ВИЧ-1 предлагают очевидные преимущества в разработке и проверке новых стратегий лечения ВИЧ 13,14,15. Гуманизированные мыши, как модель на небольших животных, могут обеспечить многолинейное восстановление иммунных клеток человека в различных тканях, что позволяет проводить тщательное изучение ВИЧ-инфекции 16,17,18,19. Среди гуманизированных моделей гуманизированная модель костного мозга-печени-тимуса (BLT) успешно рекапитулирует хроническую инфекцию ВИЧ-1, а также функциональные иммунные реакции человека на инфекцию ВИЧ-1 20,21,22,23,24. Поэтому гуманизированная модель мыши BLT широко используется для изучения различных аспектов в области исследований ВИЧ. Гуманизированные мыши BLT являются не только хорошо зарекомендовавшими себя моделями для рекапитуляции персистирующей инфекции ВИЧ-1 и патогенеза, но и последовательными инструментами для оценки стратегий вмешательства на основе клеточной терапии. Нынешние авторы и другие продемонстрировали, что гуманизированная модель мышей BLT рекапитулирует персистирующую инфекцию ВИЧ-1 и патогенез 25,26,27 и предоставляет инструменты для оценки стратегий вмешательства на основе клеточной терапии 28,29,30,31,32,33.
Схемы cART, состоящие из комбинаций антиретровирусных препаратов, которые ежедневно принимаются, подавляют репликацию ВИЧ-1 до такой степени, что вирусная нагрузка у успешно пролеченных лиц остается неопределяемой в течение длительноговремени 34. Результаты лечения ВИЧ-инфицированных гуманизированных мышей клинически значимыми схемами кАРТ аналогичны тем, которые наблюдались у ВИЧ-1 инфицированных АРТ лиц22: уровни ВИЧ-1 подавляются ниже пределов обнаружения, а прерывание кАРТ приводит к отскоку репликации ВИЧ из латентного резервуара35. Подкожная (SC)27,36,37 или внутрибрюшинная (IP)37,38,39 инъекция является маршрутом, обычно используемым для лечения кАРТ у гуманизированных мышей. Однако интенсивная ежедневная инъекция вызывает стресс у животных при физическом сдерживании40. Это также трудоемко и потенциально небезопасно для исследователей из-за повышенного воздействия ВИЧ при использовании острых предметов. Пероральное введение идеально подходит для имитации абсорбции, распределения и выведения препаратов кАРТ, которые принимаются ВИЧ-1-инфицированными людьми. Пероральное введение обычно включает в себя индивидуальные и часто трудоемкие процедуры для введения антиретровирусных препаратов в стерилизованную (необходимую из-за иммунодефицита мышей) пищу 24,37,41 или воду 42,43,44,45,46 , которые могут быть или не быть химически совместимыми со многими антиретровирусными препаратами или приводить к чему-то, что мыши не будут легко есть или пить (что повлияет на дозу и уровень лекарств в организме). Новый метод перорального введения кАРТ, предложенный здесь, превосходит предыдущие попытки доставки из-за его совместимости с различными типами антиретровирусных препаратов, безопасности и простоты приготовления и введения, а также снижения стресса и беспокойства животных в результате ежедневной инъекции.
Тенофовир дизопроксил фумарат (TDF), Элвитегравир (ELV) и Ралтегравир (RAL) являются плохо водорастворимыми препаратами. Интересно, что повышенная биодоступность TDF наблюдается с жирной пищей, предполагая, что конкурентное ингибирование липаз жирной пищей может обеспечить определенную защиту TDF47. Поэтому чашки DietGel Boost были выбраны для замены обычного чау-чау для грызунов в качестве метода доставки, основанного на их скромном содержании жира (20,3 г на 100 г) по сравнению с обычным чау-чау грызунов (10 г на 100 г) и типичной диетой с высоким содержанием жиров у мышей (40-60 г на 100 г)48. Общий вес одной чашки составляет 75 г; таким образом, каждая чашка будет содержать количество пищи, а значит и лекарство, достаточное для пяти мышей в течение 3 дней.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

Пандемия вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) продолжает распространяться во всем мире, и в настоящее время нет вакцины против ВИЧ. Хотя комбинированная антиретровирусная терапия (кАРТ) была успешной в подавлении репликации вируса, она не может полностью уничтожить резервуар у ВИЧ-инфицированных людей. Безопасная и эффективная стратегия лечения ВИЧ-инфекции потребует многосторонних методов, и поэтому достижения животных моделей инфекции ВИЧ-1 имеют решающее значение для развития исследований в области лечения ВИЧ. Гуманизированные мыши резюмируют ключевые особенности инфекции ВИЧ-1. Гуманизированная модель мыши может быть инфицирована ВИЧ-1, а репликация вируса может контролироваться с помощью схем cART. Кроме того, прерывание cART приводит к быстрому вирусному отскоку у гуманизированных мышей. Тем не менее, введение кАРТ животному может быть неэффективным, трудным или токсичным, и многие клинически значимые схемы кАРТ не могут быть оптимально использованы. Наряду с потенциальной небезопасностью для исследователей, введение кАРТ обычно используемой интенсивной ежедневной процедурой инъекций вызывает стресс из-за физического сдерживания животного. Новый пероральный метод cART для лечения ВИЧ-1-инфицированных гуманизированных мышей, описанный в этой статье, привел к подавлению вирусемии ниже уровня обнаружения, увеличению скорости восстановления CD4 + и улучшению общего состояния здоровья у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей.

Предполагая, что средняя мышь с весом 25 г потребляет 4 г пищи в день, суточная доза препарата при пероральном приеме соответствует 2,88 мг / кг TFV, 83 мг / кг FTC и 768 мг / кг RAL. Чтобы проверить, является ли оптимизированный режим питания токсичным и влияет ли на общее состояние здоровья по сравнен...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Этот протокол описывает новый метод доставки пероральных комбинированных антиретровирусных препаратов, которые успешно подавляют репликацию РНК ВИЧ-1 у гуманизированных мышей.

Пероральное комбинированное антиретровирусное лечение у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Этот протокол описывает новый метод доставки пероральных комбинированных антиретровирусных препаратов, или АРТ, который успешно подавляет репликацию РНК ВИЧ у гуманизированных мышей. Новый пероральный метод АРТ превосходит предыдущие попытки доставки благодаря своей безопасности, простоте подготовки и введения, а также снижению стресса животных в результате ежедневной инъекции. Предлагаемый метод пероральной доставки для подавления репликации РНК ВИЧ у гуманизированных мышей будет очень ценным для доклинических исследований по разработке новых методов лечения, которые точно имитируют доставку лекарств у хронических ВИЧ-инфицированных людей.Продемонстрировать процедуру будет Валери Резак, заведующая лабораторией и техник из нашей лаборатории. Начните с взвешивания отдельных препаратов. Сделайте 10 пищевых стаканчиков с cART, используя стерильные клеточные скребки, чтобы взвесить 250 миллиграммов FTC, 375 миллиграммов TDF и 500 миллиграммов RAL или ELV в отдельные стерильные 50-миллилитровые центрифужные трубки в шкафу биобезопасности.Добавьте DMSO в трубку FTC и TDF, чтобы составить конечную концентрацию 250 миллиграммов на миллилитр, и в трубку RAL или ELV до конечной концентрации 500 миллиграммов на миллилитр. Смешайте раствор препарата путем перемешивания и пипетирования до получения прозрачного раствора. Стерилизуйте растворы с помощью 0,22-микрометрового гидрофильного мембранного фильтра PVDF со стерильным шприцем.Отдельные лекарственные растворы можно хранить при минус 20 градусах Цельсия в течение 12 недель. Только что разморозьте по одной аликвоте каждого раствора препарата перед применением при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Хорошо перемешать с помощью пипетки.Смешайте препараты, растворенные в ДМСО, и хорошо перемешайте, чтобы получить мастер-микс, содержащий один миллилитр FTC, 1,5 миллилитра TDF и один миллилитр ELV или RAL. Добавьте 350 микролитров раствора cART master mix в чашку, чтобы приготовить одну чашку диетического геля для повышения cART. Добавьте в чашку 0,75 миллилитра триметоприма сульфаметоксазола.Тщательно перемешайте, используя одномиллилитрные стерильные наконечники пипетки. Используя наконечник пипетки, аликвотируйте чашку с пищей, содержащую cART, на 60-миллиметровую чашку Петри. Рассчитайте количество cART в чашке с пищей, взвесив пищу для каждой клетки в соответствии с количеством мышей.Выньте обычный чау из клетки и замените его чашкой с пищей, содержащей cART. Обновляйте пищу cART три раза в неделю. Взвешивайте использованные чашки для контроля потребления.Затем взвешивайте мышей еженедельно, чтобы подтвердить потребление. После четырех недель заражения ВИЧ-1 мышей лечили еще 7,5 недель, либо схемой FTC/TDF/RAL через подкожную инъекцию, либо пероральным введением FTC/TDF/RAL или FTC/TDF/ELV. Вес мышей постоянно снижался во время ежедневной подкожной инъекции кАРТ.Напротив, диетический гель восстанавливал вес мышей до уровня до начала АРТ после пяти недель перорального приема кАРТ. Кроме того, не наблюдалось значительных изменений веса между группами RAL или ELV. В течение четырех недель режим питания FTC/TDF/ELV и RAL/ART подавлял репликацию вируса на 100% и 80% соответственно.70% мышей, получавших инъекцию SC, достигли неопределяемых уровней после четырех недель лечения. Результаты подтвердили, что пероральное введение подавляло репликацию вируса быстрее и эффективнее, чем подкожные инъекции. Кроме того, режим питания cART предотвращал дальнейшее снижение соотношения CD4 к CD8 в периферической крови раньше, чем ежедневные инъекции.Крайне важно поддерживать стерильность любого материала, участвующего в протоколе, в течение всего процесса и избегать многократного замораживания и оттаивания раствора запасов cART.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Подготовка и использование инфицированных ВИЧ-1 Первичная CD4 + Т-клеток в качестве клеток-мишеней в естественных киллеров сотовый Цитотоксические Анализы

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Усиление и Количественная РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения стандартными клиническими Анализы

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

В пробирке раздевания ВИЧ-1 сердечников

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Изображений ВИЧ-1 Envelope-индуцированной Вирусологические Synapse и сигнализации на синтетической Бислои липидов

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Новые методы для расширения регуляторных Т-клеток от ВИЧ-1-инфицированных

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Конформационный Оценка ВИЧ-1 тримерных гликопротеинов с помощью мобильного основе ELISA Пробирной

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Выделение экзосомы из плазмы ВИЧ-1-инфицированных

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...