Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
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Nos gustaría agradecer a los doctores Romas Geleziunas y Jeff Murry y a la gente de Gilead por proporcionar los medicamentos antirretrovirales utilizados en este estudio. Este trabajo fue financiado por NCI 1R01CA239261-01 (a Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core y Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (a Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Este trabajo también fue apoyado por el Instituto del SIDA de UCLA, el James B. Pendleton Charitable Trust y la Fundación de la Familia McCarthy.

El tejido fetal humano anónimo fue adquirido comercialmente. La investigación con animales se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de California, Los Ángeles y el Comité de Investigación Animal (ARC) (UCLA) de acuerdo con todas las pautas federales, estatales y locales. Específicamente, todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones y pautas para el alojamiento y cuidado de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la Asoc...

Aquí se desarrolla un método de administración oral de cART para ratones humanizados infectados con VIH-1 mediante la combinación de tres medicamentos antirretrovirales dentro de alimentos ricos en nutrientes. En comparación con la administración por inyecciones diarias, la administración oral es más fácil de usar, limita la frecuencia de administración, reduce el manejo de animales, minimiza el estrés y mejora la seguridad55. Hasta este momento, sólo unos pocos estudios en ratones hum...

La esperanza de vida de los individuos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana crónica (VIH) ha mejorado significativamente con el tratamiento antirretroviral combinado (TARV)1,2. El cART reduce con éxito la replicación del VIH-1 y aumenta el recuento de células T CD4+ a la normalidad en la mayoría de los participantes infectados crónicamente por VIH-13, lo que resulta en una mejor salud general y una reducción drástica de la progresión de la enfermedad4. Sin embargo, el reservorio latente del VIH-1 se establece incluso cuando el TAR se inicia durante la infección aguda 5,6,7. Los reservorios persisten durante años durante el TAR y el rápido rebote viral después de la interrupción del TAR está bien documentado 8,9. Las personas que viven con VIH en tratamiento antirretroviral también están predispuestas a un mayor riesgo de comorbilidades como enfermedades cardiovasculares, cáncer y trastornos neurológicos10,11,12. Por lo tanto, se necesita una cura funcional para el VIH. Los modelos animales para la infección por VIH-1 ofrecen ventajas obvias en el desarrollo y validación de nuevas estrategias de curación del VIH13,14,15. Los ratones humanizados, como modelo animal pequeño, pueden proporcionar la reconstitución de células inmunes humanas multilinaje en diferentes tejidos, lo que permite el estudio detallado de la infección por VIH16,17,18,19. Entre los modelos humanizados, el modelo humanizado de médula ósea-hígado-timo (BLT) recapitula con éxito la infección crónica por VIH-1, así como las respuestas inmunes humanas funcionales a la infección por VIH-1 20,21,22,23,24. Por lo tanto, el modelo de ratón BLT humanizado se ha utilizado ampliamente para investigar diversos aspectos en el campo de la investigación del VIH. Los ratones BLT humanizados no solo son modelos bien establecidos para la recapitulación de la infección persistente por VIH-1 y la patogénesis, sino también herramientas consecuentes para la evaluación de estrategias de intervención basadas en la terapia celular. Los autores actuales y otros han demostrado que el modelo humanizado de ratones BLT recapitula la infección persistente por VIH-1 y la patogénesis 25,26,27 y proporciona herramientas para evaluar las estrategias de intervención basadas en la terapia celular 28,29,30,31,32,33. 
Los regímenes de cART que consisten en combinaciones de medicamentos antirretrovirales que se toman diariamente suprimen la replicación del VIH-1 hasta el punto de que la carga viral en individuos tratados con éxito permanece indetectable a largo plazo34. Los resultados del tratamiento de ratones humanizados infectados por el VIH con regímenes de TAR clínicamente relevantes se asemejan a los observados en individuos tratados con TAR infectados por VIH-122: los niveles de VIH-1 se suprimen por debajo de los límites de detección y la interrupción de los resultados de cART en un rebote de la replicación del VIH desde el reservorio latente35. La inyección subcutánea (SC)27,36,37 o intraperitoneal (IP)37,38,39 es la vía comúnmente utilizada para el tratamiento del TAR cART en ratones humanizados. Sin embargo, la inyección diaria intensiva induce estrés a los animales por restricción física40. También requiere mucha mano de obra y es potencialmente inseguro para los investigadores debido a una mayor exposición al VIH mientras se usan objetos punzantes. La administración oral es ideal para imitar la absorción, distribución y excreción de los fármacos antirretrovirales que toman las personas infectadas por el VIH-1. La administración oral generalmente implica procedimientos personalizados y a menudo laboriosos para poner los medicamentos antirretrovirales en alimentos esterilizados (necesarios debido a la inmunodeficiencia de los ratones) 24,37,41 o agua 42,43,44,45,46 , que puede o no ser químicamente compatible con muchos medicamentos antirretrovirales, o resultar en algo que los ratones no comerían o beberían fácilmente (lo que afectaría la dosis y los niveles de medicamentos en el cuerpo). El novedoso método de administración de cART peroral propuesto aquí supera los intentos de administración anteriores debido a su compatibilidad con diferentes tipos de medicamentos antirretrovirales, seguridad y facilidad de preparación y administración, y reducción del estrés y la ansiedad de los animales como resultado de la inyección diaria.
Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) y Raltegravir (RAL) son fármacos poco solubles en agua. Curiosamente, se observa una mayor biodisponibilidad de TDF con alimentos grasos, lo que sugiere que la inhibición competitiva de las lipasas por los alimentos grasos puede proporcionar cierta protección para TDF47. Por lo tanto, las tazas DietGel Boost fueron seleccionadas para reemplazar la comida regular para roedores como método de administración en función de su modesto contenido de grasa (20,3 g por 100 g) en comparación con la comida regular para roedores (10 g por 100 g) y una dieta típica alta en grasas para ratones (40-60 g por 100 g)48. El peso total de una taza es de 75 g; Por lo tanto, cada taza contendrá la cantidad de alimento y, por lo tanto, medicamento, suficiente para cinco ratones durante 3 días.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

La pandemia del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) continúa propagándose sin cesar en todo el mundo, y actualmente no hay ninguna vacuna disponible contra el VIH. Aunque la terapia antirretroviral combinada (cART) ha tenido éxito en la supresión de la replicación viral, no puede erradicar completamente el reservorio de individuos infectados por el VIH. Una estrategia de curación segura y eficaz para la infección por VIH requerirá métodos múltiples y, por lo tanto, los avances de los modelos animales para la infección por VIH-1 son fundamentales para el desarrollo de la investigación de la cura del VIH. Los ratones humanizados recapitulan las características clave de la infección por VIH-1. El modelo de ratón humanizado puede ser infectado por VIH-1 y la replicación viral puede controlarse con regímenes de cART. Además, la interrupción del cART resulta en un rápido rebote viral en ratones humanizados. Sin embargo, la administración de cART al animal puede ser ineficaz, difícil o tóxica, y muchos regímenes de cART clínicamente relevantes no pueden utilizarse de manera óptima. Además de ser potencialmente inseguro para los investigadores, la administración de cART mediante un procedimiento de inyección diaria intensiva comúnmente utilizado induce estrés por la restricción física del animal. El nuevo método oral de cART para tratar ratones humanizados infectados con VIH-1 descrito en este artículo resultó en la supresión de la viremia por debajo del nivel de detección, una mayor tasa de restauración de CD4 + y una mejor salud general en ratones humanizados infectados con VIH-1.

Suponiendo que un ratón promedio que pesa 25 g consume 4 g de alimento por día, la dosis diaria del fármaco a través de la ingesta oral corresponde a 2,88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC y 768 mg / kg RAL. Para probar si el régimen alimenticio optimizado es tóxico e influye en la salud general en comparación con la inyección diaria de cART, el peso de los ratones se controló semanalmente antes y durante el cART mediante inyección oral o subcutánea. No hubo diferencias significativas de peso antes de la administrac...

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Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Este protocolo describe un método novedoso para administrar medicamentos antirretrovirales combinados orales que suprimen con éxito la replicación del ARN del VIH-1 en ratones humanizados.

Tratamiento antirretroviral combinado oral en ratones humanizados infectados con VIH-1

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Este protocolo describe un método novedoso para administrar medicamentos antirretrovirales de combinación oral, o ART, que suprime con éxito la replicación del ARN del VIH en ratones humanizados. El novedoso método de ART oral supera los intentos de administración anteriores debido a su seguridad, facilidad de preparación y administración, y reducción del estrés animal resultante de una inyección diaria. El método de administración oral propuesto para suprimir la replicación del ARN del VIH en ratones humanizados será muy valioso para los estudios preclínicos de prueba de concepto para desarrollar nuevos tratamientos de curación que imiten estrechamente la administración de medicamentos en individuos infectados crónicamente por el VIH.Demostrando el procedimiento estará Valerie Rezak, gerente de laboratorio y técnica de nuestro laboratorio. Comience por pesar medicamentos individuales. Haga 10 tazas de comida con cART usando raspadores de células estériles para pesar 250 miligramos de FTC, 375 miligramos de TDF y 500 miligramos de RAL o ELV en tubos centrífugos individuales y estériles de 50 mililitros en un gabinete de bioseguridad.Agregue DMSO al tubo FTC y TDF para formar una concentración final de 250 miligramos por mililitro, y en el tubo RAL o ELV a una concentración final de 500 miligramos por mililitro. Mezcle la solución del medicamento agitando y pipeteando hasta obtener una solución transparente. Esterilice las soluciones utilizando un filtro de membrana de PVDF hidrófilo de 0,22 micrómetros con una jeringa estéril.Las soluciones farmacológicas individuales se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante 12 semanas. Descongele recientemente una alícuota de cada solución farmacológica antes de usarla a 37 grados centígrados hasta que la solución se aclare. Mezclar bien con una pipeta.Combine los medicamentos disueltos en DMSO y mezcle bien para formar una mezcla maestra que contenga un mililitro de FTC, 1.5 mililitros de TDF y un mililitro de ELV o RAL. Agregue 350 microlitros de la solución de mezcla maestra cART en una taza para preparar una taza de cART de refuerzo de gel dietético. Agregue 0.75 mililitros de trimetoprima sulfametoxasol en la taza.Revuelva bien con puntas de pipeta estéril de un mililitro. Con una punta de pipeta, alícuota la taza de comida que contiene cART en una placa de Petri de 60 milímetros. Calcule la cantidad de cART en la taza de comida pesando la comida para cada jaula de acuerdo con el número de ratones.Retire la comida regular de la jaula y reemplácela con una taza de comida que contenga cART. Refresque los alimentos cART tres veces por semana. Pese las tazas usadas para controlar la ingesta.Luego, pesa los ratones semanalmente para confirmar el consumo. Después de cuatro semanas de infección por VIH-1, los ratones fueron tratados durante otras 7,5 semanas, ya sea con régimen FTC/TDF/RAL mediante inyección subcutánea o mediante administración oral de FTC/TDF/RAL o FTC/TDF/ELV. El peso del ratón disminuyó continuamente durante la inyección subcutánea diaria de cART.En contraste, el gel dietético restauró el peso del ratón a los niveles de iniciación previos al TAR después de cinco semanas de administración oral de cART. Además, no se observaron cambios significativos de peso entre los grupos RAL o ELV. En cuatro semanas, el régimen alimenticio FTC/TDF/ELV y RAL/ART suprimió la replicación viral en un 100% y 80% respectivamente.El 70% de los ratones que recibieron inyección SC alcanzaron niveles indetectables después de cuatro semanas de tratamiento. Los resultados confirmaron que la administración oral suprimió la replicación viral de manera más rápida y eficiente que las inyecciones subcutáneas. Además, el régimen alimenticio cART previno la disminución adicional de las proporciones de CD4 a CD8 en la sangre periférica antes de las inyecciones diarias.Es fundamental mantener la esterilidad de cualquier material involucrado en el protocolo durante todo el proceso y evitar la congelación y descongelación múltiple de la solución de material de cART.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...