Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Vi vill tacka Drs. Romas Geleziunas och Jeff Murry och folket på Gilead för att tillhandahålla de antiretrovirala läkemedel som används i denna studie. Detta arbete finansierades av NCI 1R01CA239261-01 (till Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core och Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PI: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (till Zhen), NIAID R2120200174 (PI: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Detta arbete stöddes också av UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust och McCarthy Family Foundation.

Anonymiserad mänsklig fostervävnad förvärvades kommersiellt. Djurförsök utfördes enligt protokoll som godkänts av University of California, Los Angeles och (UCLA) Animal Research Committee (ARC) i enlighet med alla federala, statliga och lokala riktlinjer. Specifikt utfördes alla experiment i enlighet med rekommendationerna och riktlinjerna för boende och vård av laboratoriedjur från National Institutes of Health (NIH) och Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) Inte...

En oral cART-administreringsmetod utvecklas här för HIV-1-infekterade humaniserade möss genom att kombinera tre antiretrovirala läkemedel inom livsmedel med hög näringshalt. Jämfört med administrering genom dagliga injektioner är oral leverans lättare att använda, begränsar administreringsfrekvensen, minskar djurhanteringen, minimerar stress och förbättrar säkerheten55. Fram till denna punkt har endast ett fåtal studier på humaniserade möss 24,37,41 använt matpellets som innehå...

Den förväntade livslängden för patienter med kroniskt humant immunbristvirus (HIV)-infekterade individer har förbättrats avsevärt med antiretroviral kombinationsbehandling (cART)1,2. cART minskar framgångsrikt HIV-1-replikationen och ökar antalet CD4 + T-celler till normalitet hos majoriteten av HIV-1 kroniskt infekterade deltagare3, vilket resulterar i förbättrad allmän hälsa och dramatiskt minskad sjukdomsprogression4. Den latenta HIV-1-reservoaren etableras dock även när ART initieras under akut infektion 5,6,7. Reservoarer kvarstår under flera år under ART och snabb viral återhämtning efter ART-avbrott är väldokumenterad 8,9. Personer som lever med HIV på ART är också predisponerade för en högre risk för comorbiditeter som hjärt-kärlsjukdom, cancer och neurostörningar10,11,12. Därför behövs ett funktionellt botemedel mot hiv. Djurmodeller för HIV-1-infektion erbjuder uppenbara fördelar när det gäller att utveckla och validera nya HIV-botemedelsstrategier13,14,15. Humaniserade möss, som en liten djurmodell, kan ge multilineage mänsklig immuncellsrekonstitution i olika vävnader, vilket möjliggör en noggrann studie av HIV-infektion16,17,18,19. Bland humaniserade modeller rekapitulerar den humaniserade benmärgs-lever-tymus (BLT) -modellen framgångsrikt kronisk HIV-1-infektion samt funktionella mänskliga immunsvar mot HIV-1-infektion 20,21,22,23,24. Därför har den humaniserade BLT-musmodellen använts i stor utsträckning för att undersöka olika aspekter inom HIV-forskningsområdet. Humaniserade BLT-möss är inte bara väletablerade modeller för rekapitulation av ihållande HIV-1-infektion och patogenes, utan också följdverktyg för utvärdering av cellterapibaserade interventionsstrategier. De nuvarande författarna och andra har visat att den humaniserade BLT-mössmodellen rekapitulerar ihållande HIV-1-infektion och patogenes 25,26,27 och ger verktyg för att utvärdera cellterapibaserade interventionsstrategier 28,29,30,31,32,33. 
cART-regimer som består av kombinationer av antiretrovirala läkemedel som dagligen undertrycker HIV-1-replikation till den grad att virusbelastningen hos framgångsrikt behandlade individer förblir omöjlig att upptäcka på lång sikt34. Resultaten av behandling av HIV-infekterade humaniserade möss med kliniskt relevanta cART-regimer liknar de som observerats hos HIV-1-infekterade ART-behandlade individer22: HIV-1-nivåer undertrycks under gränserna för detektion och avbrott av cART resulterar i en rebound av HIV-replikation från den latenta reservoaren35. Subkutan (SC)27,36,37 eller intraperitoneal (IP)37,38,39 injektion är den väg som vanligtvis används för cART-behandling hos humaniserade möss. Intensiv daglig injektion inducerar dock stress för djur genom fysisk fasthållning40. Det är också arbetskrävande och potentiellt osäkra för forskare på grund av ökad exponering för HIV när de använder vassa föremål. Oral administrering är idealisk för att efterlikna absorption, distribution och utsöndring av cART-läkemedel som tas av HIV-1-infekterade individer. Oral administrering innebär vanligtvis anpassade och ofta mödosamma procedurer för att sätta de antiretrovirala läkemedlen i steriliserad (nödvändig på grund av mössens immunbrist) mat 24,37,41 eller vatten 42,43,44,45,46 , som kan eller inte kan vara kemiskt kompatibla med många antiretrovirala läkemedel, eller resultera i något som mössen inte lätt skulle äta eller dricka (vilket skulle påverka dos- och läkemedelsnivåerna i kroppen). Den nya perorala cART-administreringsmetoden som föreslås här överträffar tidigare leveransförsök på grund av dess kompatibilitet med olika typer av antiretrovirala läkemedel, säkerhet och enkel beredning och administrering och minskning av djurstress och ångest till följd av den dagliga injektionen.
Tenofovirdisoproxilfumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) och Raltegravir (RAL) är dåligt vattenlösliga läkemedel. Intressant nog observeras ökad biotillgänglighet av TDF med feta livsmedel, vilket tyder på att konkurrenskraftig hämning av lipaser av fet mat kan ge ett visst skydd för TDF47. Därför valdes DietGel Boost-koppar för att ersätta vanlig gnagare chow som leveransmetod baserat på deras blygsamma fettinnehåll (20,3 g per 100 g) jämfört med vanlig gnagare chow (10 g per 100 g) och en typisk musrik diet med hög fetthalt (40-60 g per 100 g)48. Den totala vikten av en kopp är 75 g; Således kommer varje kopp att innehålla mängden mat, och därför läkemedel, tillräckligt för fem möss över 3 dagar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

Pandemin med humant immunbristvirus (HIV-1) fortsätter att spridas med oförminskad styrka över hela världen, och för närvarande finns det inget vaccin tillgängligt mot HIV. Även om kombinationsantiretroviral terapi (cART) har lyckats undertrycka viral replikation, kan den inte helt utrota reservoaren från HIV-infekterade individer. En säker och effektiv botstrategi för HIV-infektion kommer att kräva mångsidiga metoder, och därför är framstegen med djurmodeller för HIV-1-infektion avgörande för utvecklingen av HIV-botemedelsforskning. Humaniserade möss rekapitulerar viktiga funktioner i HIV-1-infektion. Den humaniserade musmodellen kan infekteras av HIV-1 och viral replikation kan kontrolleras med cART-regimer. Dessutom resulterar cART-avbrott i en snabb viral rebound hos humaniserade möss. Administrering av cART till djuret kan dock vara ineffektivt, svårt eller giftigt, och många kliniskt relevanta cART-regimer kan inte utnyttjas optimalt. Tillsammans med att vara potentiellt osäkra för forskare, inducerar administrering av cART genom ett vanligt intensivt dagligt injektionsförfarande stress genom fysisk fasthållning av djuret. Den nya orala cART-metoden för att behandla HIV-1-infekterade humaniserade möss som beskrivs i denna artikel resulterade i undertryckande av viremi under detektionsnivån, ökad hastighet av CD4 + -restaurering och förbättrad allmän hälsa hos HIV-1-infekterade humaniserade möss.

Förutsatt att en genomsnittlig mus som väger 25 g konsumerar 4 g mat per dag, motsvarar den dagliga läkemedelsdosen genom oralt intag 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC och 768 mg/kg RAL. För att testa om den optimerade matregimen är giftig och påverkar den allmänna hälsan jämfört med daglig injektion av cART övervakades mössens vikt varje vecka före och under cART genom oral eller subkutan injektion. Det fanns inga signifikanta viktskillnader före administrering av cART i varje grupp (figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Detta protokoll beskriver en ny metod för att leverera orala kombinations-antiretrovirala läkemedel som framgångsrikt undertrycker HIV-1 RNA-replikation hos humaniserade möss.

Antiretroviral behandling i oral kombination hos HIV-1-infekterade humaniserade möss

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Detta protokoll beskriver en ny metod för att leverera antiretrovirala läkemedel med oral kombination, eller ART, som framgångsrikt undertrycker HIV RNA-replikation hos humaniserade möss. Den nya orala ART-metoden överträffar tidigare leveransförsök på grund av dess säkerhet, enkel förberedelse och administrering och minskad djurstress till följd av en daglig injektion. Den föreslagna orala leveransmetoden för att undertrycka HIV-RNA-replikation hos humaniserade möss kommer att vara mycket värdefull för prekliniska proof-of-concept-studier för att utveckla nya botemedelsbehandlingar som nära efterliknar läkemedelsleveransen hos kroniska HIV-infekterade individer.Demonstrerar proceduren kommer att vara Valerie Rezak, en laboratoriechef och tekniker från vårt laboratorium. Börja med att väga enskilda droger. Gör 10 matkoppar med cART med sterila cellskrapor för att väga ut 250 milligram FTC, 375 milligram TDF och 500 milligram RAL eller ELV till enskilda, sterila 50-milliliters centrifugrör i ett biosäkerhetsskåp.Tillsätt DMSO till FTC- och TDF-röret för att kompensera en slutlig koncentration på 250 milligram per milliliter och i RAL- eller ELV-röret till en slutlig koncentration på 500 milligram per milliliter. Blanda läkemedelslösningen genom omrörning och pipettering tills en klar lösning erhålls. Sterilisera lösningarna med ett 0,22 mikrometer hydrofilt PVDF-membranfilter med en steril spruta.Individuella läkemedelslösningar kan förvaras vid minus 20 grader Celsius i 12 veckor. Tina nyligen en alikvot av varje läkemedelslösning före användning vid 37 grader Celsius tills lösningen blir klar. Blanda väl med en pipett.Kombinera läkemedlen upplösta i DMSO och blanda väl för att bilda en masterblandning som innehåller en milliliter FTC, 1,5 ml TDF och en milliliter ELV eller RAL. Tillsätt 350 mikroliter cART master mix-lösning i en kopp för att förbereda en diet gel boost cART kopp. Tillsätt 0,75 ml trimetoprimsulfametoxasol i koppen.Rör om noggrant med en milliliter sterila pipettspetsar. Använd en pipettspets och alikvotera matkoppen som innehåller cART på en 60-millimeters petriskål. Beräkna mängden cART i matkoppen genom att väga maten för varje bur enligt antalet möss.Ta bort vanlig chow från buret och ersätt den med en matkopp som innehåller cART. Uppdatera cART mat tre gånger i veckan. Väg använda koppar för att övervaka intaget.Väg sedan mössen varje vecka för att bekräfta konsumtionen. Efter fyra veckors HIV-1-infektion behandlades möss i ytterligare 7,5 veckor, antingen med FTC/TDF/RAL-behandling genom subkutan injektion eller genom oral administrering av FTC/TDF/RAL eller FTC/TDF/ELV. Musens vikt minskade kontinuerligt under daglig subkutan injektion med cART.Däremot återställde dietgel musvikter till pre-ART-initieringsnivåer efter fem veckors oral cART-administrering. Dessutom observerades inga signifikanta viktförändringar mellan RAL- eller ELV-grupper. Inom fyra veckor undertryckte FTC / TDF / ELV och RAL / ART matregimen virusreplikationen med 100% respektive 80%.70% av mössen som fick SC-injektion nådde omätbara nivåer efter fyra veckors behandling. Resultaten bekräftade att oral administrering undertryckte viral replikation snabbare och mer effektivt än subkutana injektioner. Dessutom förhindrade cART-matregimen den ytterligare nedgången av CD4 till CD8-förhållanden i perifert blod tidigare än dagliga injektioner.Det är viktigt att upprätthålla sterilitet hos allt material som är involverat i protokollet under hela processen och undvika flera frysningar och upptining av cART-stamlösningen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Beredning och användning av HIV-1 infekterade Primär CD4 + T-celler som målceller i Natural Cytotoxiska Killer Cell analyser

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 kärnor

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Avbildning av HIV-1 kuvert-inducerad Virologiskt Synapse och signalering av syntetiska lipiddubbelskikt

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nya verktyg för att expandera reglerande T-celler från HIV-1-infekterade individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Utvärdering av HIV-1 trimera Envelope Glycoproteins användning av en cellbaserad ELISA-analys

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av exosomes från plasma HIV-1 positiva individer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...