Name: oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Bu çalışmada kullanılan antiretroviral ilaçları sağladıkları için Dr. Romas Geleziunas ve Jeff Murry'ye ve Gilead'deki insanlara teşekkür ederiz. Bu çalışma NCI 1R01CA239261-01 (Mutfağa), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Viroloji Çekirdeği, Gen ve Hücre Terapisi Çekirdeği ve İnsanlaştırılmış Fare Çekirdeği), U19AI149504 (PI'ler: Mutfak ve Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (Zhen'e), NIAID R2120200174 (PI'ler: Xie ve Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo) tarafından finanse edildi. Bu çalışma UCLA AIDS Enstitüsü, James B. Pendleton Charitable Trust ve McCarthy Aile Vakfı tarafından da desteklendi.

Anonimleştirilmiş insan fetal dokusu ticari olarak edinildi. Hayvan araştırmaları, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles ve (UCLA) Hayvan Araştırma Komitesi (ARC) tarafından onaylanan protokollere göre, tüm federal, eyalet ve yerel yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Özellikle, tüm deneyler, UCLA ARC Protokol Numarası 2010-038-02B kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği (AALAC) laboratuva...

Burada, HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareler için, yüksek besleyici gıdalar içinde üç antiretroviral ilacı birleştirerek oral bir cART uygulama yöntemi geliştirilmiştir. Günlük enjeksiyonlarla yapılan uygulamayla karşılaştırıldığında, oral teslimatın kullanımı daha kolaydır, uygulama sıklığını sınırlar, hayvan kullanımını azaltır, stresi en aza indirir ve güvenliği artırır55. Bu noktaya kadar, insanlaştırılmış farelerde yapılan sadec...

Kronik insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfekte bireylerin yaşam beklentisi, kombinasyonel antiretroviral tedavi (cART) ile anlamlı derecede iyileşmiştir1,2. cART, HIV-1 replikasyonunu başarılı bir şekilde azaltır ve kronik olarak enfekte olmuş katılımcıların çoğunda CD4 + T hücre sayısını normale yükseltir3, bu da genel sağlığın iyileşmesine ve hastalığın ilerlemesini önemli ölçüde azaltmasına neden olur4. Bununla birlikte, gizli HIV-1 rezervuarı, akut enfeksiyon sırasında ART başlatıldığında bile kurulur 5,6,7. Rezervuarlar YÜT sırasında yıllar içinde devam eder ve YÜT kesintisinden sonra hızlı viral geri tepme iyi belgelenmiştir 8,9. ART üzerinde HIV ile yaşayan insanlar ayrıca kardiyovasküler hastalık, kanser ve nöro bozukluklar gibi daha yüksek komorbidite riskine yatkındır10,11,12. Bu nedenle, HIV için fonksiyonel bir tedaviye ihtiyaç vardır. HIV-1 enfeksiyonu için hayvan modelleri, yeni HIV tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde ve doğrulanmasında belirgin avantajlar sunmaktadır13,14,15. İnsanlaştırılmış fareler, küçük bir hayvan modeli olarak, farklı dokularda çok soylu insan bağışıklık hücresi resutansiyonu sağlayabilir, bu da HIV enfeksiyonunun yakından incelenmesine izin verir16,17,18,19. İnsanlaştırılmış modeller arasında, insanlaştırılmış kemik iliği-karaciğer-timus (BLT) modeli, kronik HIV-1 enfeksiyonunun yanı sıra HIV-1 enfeksiyonuna karşı fonksiyonel insan bağışıklık tepkilerini başarıyla özetler20,21,22,23,24. Bu nedenle, insanlaştırılmış BLT fare modeli, HIV araştırma alanındaki çeşitli yönleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsanlaştırılmış BLT fareleri sadece kalıcı HIV-1 enfeksiyonu ve patogenezinin özetlenmesi için iyi kurulmuş modeller değil, aynı zamanda hücre tedavisine dayalı müdahale stratejilerinin değerlendirilmesi için sonuç niteliğinde araçlardır. Mevcut yazarlar ve diğerleri, insanlaştırılmış BLT fareleri modelinin kalıcı HIV-1 enfeksiyonu ve patogenezi25,26,27'yi özetlediğini ve hücre tedavisine dayalı müdahale stratejilerini değerlendirmek için araçlar sağladığını göstermiştir 28,29,30,31,32,33.
Günlük olarak alınan antiretroviral ilaçların kombinasyonlarından oluşan cART rejimleri, başarılı bir şekilde tedavi edilen bireylerde viral yükün uzun süre34 boyunca tespit edilemediği noktaya kadar HIV-1 replikasyonunu baskılar. HIV ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelerin klinik olarak ilgili cART rejimleriyle tedavi edilmesinin sonuçları, HIV-1 ile enfekte olmuş ART ile tedavi edilen bireylerde gözlenenlere benzemektedir22: HIV-1 seviyeleri, cART'nin tespit ve kesinti sınırlarının altında bastırılır ve bu da HIV replikasyonunun gizli rezervuardan geri tepmesine neden olur35. Subkutan (SC)27,36,37 veya intraperitoneal (IP)37,38,39 enjeksiyonu, insanlaştırılmış farelerde cART tedavisinde yaygın olarak kullanılan yoldur. Bununla birlikte, yoğun günlük enjeksiyon, fiziksel kısıtlama40 ile hayvanlara strese neden olur. Ayrıca, keskin nişan kullanırken HIV'e daha fazla maruz kalma nedeniyle araştırmacılar için emek yoğun ve potansiyel olarak güvensizdir. Oral uygulama, HIV-1 ile enfekte olmuş bireyler tarafından alınan cART ilaçlarının emilimini, dağılımını ve atılımını taklit etmek için idealdir. Oral uygulama tipik olarak, antiretroviral ilaçları sterilize edilmiş (farelerin immün yetmezliği nedeniyle gerekli) gıda 24,37,41 veya su42,43,44,45,46 içine koymak için özelleştirilmiş ve sıklıkla zahmetli prosedürleri içerir. Birçok antiretroviral ilaçla kimyasal olarak uyumlu olabilir veya olmayabilir veya farelerin kolayca yiyemeyeceği veya içmeyeceği bir şeyle sonuçlanabilir (bu da vücuttaki doz ve ilaç seviyelerini etkiler). Burada önerilen yeni peroral cART uygulama yöntemi, farklı antiretroviral ilaç türleriyle uyumluluğu, güvenliği ve hazırlık ve uygulama kolaylığı ve günlük enjeksiyondan kaynaklanan hayvan stresi ve kaygısının azaltılması nedeniyle önceki doğum girişimlerini aşmaktadır.
Tenofovir disoproksil fumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) ve Raltegravir (RAL) zayıf suda çözünür ilaçlardır. İlginç bir şekilde, TDF'nin biyoyararlanımının artması yağlı gıdalarla gözlenir, bu da lipazların yağlı gıdalarla rekabetçi inhibisyonunun TDF47 için belirli bir koruma sağlayabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, DietGel Boost bardakları, normal kemirgen chow'una (100 g başına 10 g) ve tipik bir fare yüksek yağlı diyetine (100 g başına 40-60 g) kıyasla, mütevazı yağ içeriğine (100 g başına 20.3 g) dayanarak teslimat yöntemi olarak normal kemirgen chow'unun yerini almak üzere seçilmiştir. Bir bardağın toplam ağırlığı 75 g'dır; Böylece, her fincan 3 gün boyunca beş fare için yeterli miktarda yiyecek ve dolayısıyla ilaç içerecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344722</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td>For flow data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-046-702</td>
			<td>For NSG-BLT mice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>For dissolving ART</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel Boost</td>
			<td>ClearH2O</td>
			<td>72-04-5022</td>
			<td>For making ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elvitegravir</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emtricitabine</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317306</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 forward primer: 5&#8242;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 probe: 5&#8242;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT 
			TAACTG [Tamra-Q]-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 reverse primer: 5&#8242;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&#8242;;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Customized</td>
			<td>For viral load RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fetal tissue</td>
			<td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>For constructing the humanized mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&#160;52904</td>
			<td>For measuring viral load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raltegravir</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell scrapers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>For aliquoting ART food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4392653</td>
			<td>For plasma viral load detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil fumarate</td>
			<td>Gilead</td>
			<td></td>
			<td>Gifted from Gilead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td>
			<td>Pharmaceutical Associates</td>
			<td>NDC 0121-0854-16</td>
			<td>For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 
			200 mg Sulfamethoxazole, USP 
			40 mg Trimethoprim, USP 
			NMT 0.5% Alcohol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral combinational antiretroviral treatment in hiv-1 infected humanized mice

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) pandemisi dünya çapında hız kesmeden yayılmaya devam etmektedir ve şu anda HIV'e karşı bir aşı bulunmamaktadır. Kombinasyonel antiretroviral tedavi (cART) viral replikasyonu baskılamada başarılı olmasına rağmen, rezervuarı HIV ile enfekte bireylerden tamamen yok edemez. HIV enfeksiyonu için güvenli ve etkili bir tedavi stratejisi çok yönlü yöntemler gerektirecektir ve bu nedenle HIV-1 enfeksiyonu için hayvan modellerinin ilerlemesi HIV tedavi araştırmalarının geliştirilmesi için çok önemlidir. İnsanlaştırılmış fareler, HIV-1 enfeksiyonunun temel özelliklerini özetler. İnsanlaştırılmış fare modeli HIV-1 ile enfekte olabilir ve viral replikasyon cART rejimleri ile kontrol edilebilir. Dahası, cART kesintisi, insanlaştırılmış farelerde hızlı bir viral geri tepme ile sonuçlanır. Bununla birlikte, cART'nin hayvana uygulanması etkisiz, zor veya toksik olabilir ve klinik olarak ilgili birçok cART rejimi en uygun şekilde kullanılamaz. Araştırmacılar için potansiyel olarak güvensiz olmasının yanı sıra, cART'nin yaygın olarak kullanılan yoğun bir günlük enjeksiyon prosedürü ile uygulanması, hayvanın fiziksel olarak kısıtlanmasıyla strese neden olur. Bu makalede açıklanan HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareleri tedavi etmek için yeni oral cART yöntemi, vireminin tespit seviyesinin altında baskılanmasına, CD4 + restorasyon oranının artmasına ve HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelerde genel sağlığın iyileşmesine neden olmuştur.

25 g ağırlığındaki ortalama bir farenin günde 4 g yiyecek tükettiğini varsayarsak, oral alım yoluyla günlük ilaç dozu 2.88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC ve 768 mg / kg RAL'ye karşılık gelir. Optimize edilmiş gıda rejiminin toksik olup olmadığını ve günlük cART enjeksiyonuna kıyasla genel sağlığı etkileyip etkilemediğini test etmek için, farelerin ağırlığı, oral veya deri altı enjeksiyon yoluyla cART'den önce ve sırasında haftalık olarak izlendi. Her grupta cART uygulamasından önce ...

Watch this Scientific Journal Video about Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice at JoVE.com

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

Bu protokol, insanlaştırılmış farelerde HIV-1 RNA replikasyonunu başarılı bir şekilde baskılayan oral kombinasyonel antiretroviral ilaçlar vermek için yeni bir yöntemi açıklamaktadır.

HIV-1 Enfekte İnsanlaştırılmış Farelerde Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Bu protokol, insanlaştırılmış farelerde HIV RNA replikasyonunu başarılı bir şekilde baskılayan oral kombinasyon antiretroviral ilaçlar veya ART sağlamak için yeni bir yöntemi tanımlamaktadır. Yeni oral ART yöntemi, güvenliği, hazırlık ve uygulama kolaylığı ve günlük enjeksiyondan kaynaklanan hayvan stresinin azalması nedeniyle önceki doğum girişimlerini aşmaktadır. İnsanlaştırılmış farelerde HIV RNA replikasyonunu baskılamak için önerilen oral dağıtım yöntemi, kronik HIV ile enfekte bireylerde ilaç dağıtımını yakından taklit eden yeni tedavi tedavileri geliştirmek için klinik öncesi kavram kanıtı çalışmaları için oldukça değerli olacaktır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir laboratuvar yöneticisi ve teknisyeni olan Valerie Rezak olacaktır. Bireysel ilaçları tartarak başlayın. Bir biyo-güvenlik kabininde 250 miligram FTC, 375 miligram TDF ve 500 miligram RAL veya ELV'yi bireysel, steril 50 mililitrelik santrifüj tüplerine tartmak için steril hücre kazıyıcıları kullanarak cART ile 10 gıda kabı yapın.Mililitre başına 250 miligramlık bir nihai konsantrasyon oluşturmak için DMSO'yu FTC ve TDF tüpüne ve RAL veya ELV tüpüne mililitre başına 500 miligramlık bir son konsantrasyona ekleyin. İlaç çözeltisini, berrak bir çözelti elde edilene kadar karıştırarak ve pipetleyerek karıştırın. Steril bir şırınga ile 0,22 mikrometre hidrofilik PVDF membran filtre kullanarak çözeltileri sterilize edin.Bireysel ilaç çözeltileri 12 hafta boyunca eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Çözelti netleşene kadar 37 santigrat derecede kullanmadan önce her ilaç çözeltisinin bir aliquot'unu taze olarak çözün. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın.DMSO'da çözünmüş ilaçları birleştirin ve bir mililitre FTC, 1.5 mililitre TDF ve bir mililitre ELV veya RAL içeren bir ana karışım oluşturmak için iyice karıştırın. Bir diyet jeli takviye cART fincanı hazırlamak için bir kaba 350 mikrolitre cART master karışım çözeltisi ekleyin. Bardağa 0.75 mililitre trimetoprim sülfametoksasol ekleyin.Bir mililitrelik steril pipet uçlarını kullanarak iyice karıştırın. Bir pipet ucu kullanarak, cART içeren yiyecek kabını 60 milimetrelik bir Petri kabına yapıştırın. Her kafes için yiyeceği fare sayısına göre tartarak yiyecek kabındaki cART miktarını hesaplayın.Kafesten düzenli chow'u çıkarın ve cART içeren bir yiyecek kabı ile değiştirin. CART yiyeceklerini haftada üç kez yenileyin. Alımı izlemek için kullanılmış bardakları tartın.Ardından, tüketimi onaylamak için fareleri haftalık olarak tartın. Dört haftalık HIV-1 enfeksiyonundan sonra, fareler deri altı enjeksiyon yoluyla FTC / TDF / RAL rejimi ile veya FTC / TDF / RAL veya FTC / TDF / ELV'nin oral olarak uygulanmasıyla 7.5 hafta daha tedavi edildi. Günlük cART subkutan enjeksiyonu sırasında fare ağırlığı sürekli olarak azalmıştır.Buna karşılık, diyet jeli, beş haftalık oral cART uygulamasından sonra fare ağırlıklarını ART öncesi başlangıç seviyelerine geri yükledi. Ek olarak, RAL veya ELV grupları arasında anlamlı bir ağırlık değişikliği gözlenmedi. Dört hafta içinde, FTC / TDF / ELV ve RAL / ART gıda rejimi viral replikasyonu sırasıyla% 100 ve% 80 oranında baskıladı.SC enjeksiyonu alan farelerin% 70'i dört haftalık tedaviden sonra tespit edilemeyen seviyelere ulaştı. Sonuçlar, oral uygulamanın viral replikasyonu deri altı enjeksiyonlardan daha hızlı ve daha verimli bir şekilde baskıladığını doğruladı. Ayrıca, cART gıda rejimi, periferik kandaki CD4 ila CD8 oranlarının günlük enjeksiyonlardan daha erken düşmesini önledi.Tüm proses boyunca protokolde yer alan herhangi bir malzemenin sterilitesini korumak ve cART stok çözeltisinin birden fazla donmasını ve çözülmesini önlemek çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...