Name: studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00
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Wir danken Frau Lyndsay Busby für die administrative Unterstützung und Herrn Joel Pino für die Unterstützung durch die Medien. NIH-Zuschüsse unterstützten diese Arbeit: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 und Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Mayo Clinic genehmigt.
1. Einrichtung
<ol><li>Schnelle 8- bis 10 Wochen alte Mäuse für 4 h. Geben Sie Mäusen Zugang zu Wasser. HINWEIS: Wir verwenden männliche Wildtyp-C57BL / 6J-Mäuse für alle hier vorgestellten Experimente, aber sie können an Mäusen aller Stämme, Geschlechter und Genotypen durchgeführt werden.</li>
	<li>Kühlen Sie 15 ml destilliertes Wasser in ...

<ol>
	<li>Stevens, C. E., Hume, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , (2004).</li><li>Bayliss, W. M., Starling, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movements+and+innervation+of+the+small+intestine.">The movements and innervation of the small intestine.</a> The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).</li><li>Husebye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patterns+of+small+bowel+motility:+physiology+and+implications+in+organic+disease+and+functional+disorders.">The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders.</a> Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).</li><li>Bush, T. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+human+jejunal+contractions.">Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions.</a> American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).</li><li>Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+ofcanine+postprandial+upper+gastrointestinal+motility.">Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility.</a> American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).</li><li>Mayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+feelings:+the+emerging+biology+of+gut-brain+communication.">Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).</li><li>Alcaino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+gut+epithelial+enterochromaffin+cells+is+mechanosensitive+and+requires+Piezo2+to+convert+force+into+serotonin+release.">A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).</li><li>Kugler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+activates+neurites+and+somata+of+myenteric+neurons.">Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).</li><li>Mazzuoli, G., Schemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+enteric+neurons+in+the+myenteric+plexus+of+the+mouse+intestine.">Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine.</a> PloS One. 7 (7), 39887 (2012).</li><li>Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+cells+of+Cajal+mediate+mechanosensitive+responses+in+the+stomach.">Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).</li><li>Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+myenteric+sensory+neurons+in+the+mouse+small+intestine.">Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).</li><li>McIntyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bran,+ispaghula,+and+inert+plastic+particles+on+gastric+emptying+and+small+bowel+transit+in+humans:+the+role+of+physical+factors.">Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors.</a> Gut. 40 (2), 223-227 (1997).</li><li>Treichel, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+carbon+monoxide+suppresses+the+development+of+postoperative+ileus+in+the+murine+small+intestine.">Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine.</a> Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Baeyens, N., Schwartz, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+abdominal+autofluorescence+detected+by+in+vivo+fluorescence+imaging+of+living+mice.">Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice.</a> Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).</li><li>Szarka, L. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+discrimination+in+rat+and+mouse+gastric+emptying.">Size discrimination in rat and mouse gastric emptying.</a> Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).</li><li>Zhu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+sensory+neurons+communicate+with+interstitial+cells+of+Cajal+to+affect+pacemaker+activity+in+the+small+intestine.">Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).</li><li>Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+touchy+business+of+gastrointestinal+(GI)+mechanosensitivity.">The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity.</a> Brain Research. 1693, 197-200 (2018).</li></ol>

Der Magen-Darm-Trakt benötigt wie andere röhrenförmige Organe wie Blutgefäße mechanische Sensoren und Effektoren, um die Homöostaseaufrechtzuerhalten 26,27,28. Der GI-Trakt ist jedoch insofern einzigartig, als die physikalischen Eigenschaften der Materialien, die ihn durchqueren, über die Mahlzeiten hinweg nicht konstant sind. Intraluminale Gehalte verschiedener physikalischer Eigenschaften (fest, flüssig und gasförmig)...

Der menschliche Magen-Darm-Trakt (GI) ist ein mehrere Fuß langes Organsystem, grob angenähert als Röhre mit unterschiedlichen Abmessungen und physikalischen Eigenschaften1. Während sich der Inhalt durch seine Länge bewegt, besteht die Hauptfunktion des Magen-Darm-Trakts darin, lebenswichtige Substanzen aufzunehmen. Der Dünndarm ist speziell für die Nährstoffaufnahme verantwortlich. Der Transit des Dünndarms ist streng reguliert, um den Verdauungs- und Absorptionsfunktionen zu entsprechen, was zu verschiedenen Motilitätsmustern führt. Bayliss und Starling beschrieben 1899 das "Gesetz des Darms"2 und zeigten das kontraktile Antriebsprogramm im Darm, das heute als peristaltischer Reflex bekannt ist; Das Segment in der Nähe des Nahrungsbolus zieht sich zusammen, um es vorwärts zu treiben, und das distale Segment entspannt sich, um es zu empfangen. Theoretisch könnte dieses Muster allein ausreichen, um Material aboral zu transportieren, aber über ein Jahrhundert Forschung hat ein komplexeres Bild der kontraktilen Aktivität im Magen-Darm-Trakt gezeichnet. Beim Menschen werden drei Dünndarmmotilitätsperioden erkannt: der wandernde motorische Komplex (MMC), die Fastenperiode und die postprandiale Periode3. Die gleichen Muster wurden bei Mäusenberichtet 4,5. Die MMC ist ein zyklisches motorisches Muster, das bei den meisten Säugetieren erhalten bleibt 6,7. Die MMC hat ein charakteristisches Vier-Phasen-Muster, das als nützlicher klinischer Marker bei funktionellen GI-Störungen dient7. Die vier Phasen, in der Reihenfolge ihres Auftretens, sind (I) Ruhe, (II) unregelmäßige, niedrige Amplitudenkontraktionen, (III) regelmäßige Kontraktionen mit hoher Amplitude und (IV) Ramp-down-Periode abnehmender Aktivität7. Die MMC markiert das wichtigste motorische Muster der Fastenperiode3. MMCs der Fastenzeit klären den Inhalt des Dünndarms in Vorbereitung auf die nächste Mahlzeit.
Die motorischen Muster der postprandialen Periode sind für die Verdauungs- und Absorptionsfunktionen optimiert3. Unabhängig von der kalorischen Zusammensetzung ist der anfängliche Transit schnell entlang des Dünndarms, der Inhalt wird entlang der Länge des Darms verteilt und der Transit verlangsamt sich anschließend8. Die Absorption wird optimiert, indem die Kontaktfläche vergrößert und verlangsamt wird, um die Verweilzeit zu verlängern. Sobald sich die Nährstoffe im Lumen befinden, besteht das dominante Muster aus engen (<2 cm auseinander) unkoordinierten Kontraktionen (segmentierende Kontraktionen), mit einigen überlagerten Kontraktionen mit großer Amplitude, die sich über die gesamte Länge des Dünndarms erstrecken (peristaltische Kontraktionen)9. Segmentierende Kontraktionen mischen die intraluminalen Inhalte an Ort und Stelle. Die gelegentlichen großen peristaltischen Kontraktionen treiben den Inhalt in Richtung Dickdarm.
Der Zeitpunkt dieses Übergangs zurück zu MMCs hängt vom Nahrungsvolumen und der Kalorienzusammensetzung ab10. So probiert der Dünndarm luminale Hinweise, um zu regulieren, wann zwischen den Motilitätsperioden übergegangen werden soll. Mechanische Hinweise, wie physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts11, des luminalen Volumens und der Wandspannung, greifen Mechanorezeptorzellen in der GI-Wand 12,13,14,15,16 ein. In der Tat führt die Erhöhung der festen Komponente einer Mahlzeit zu einer Zunahme des Dünndarmtransits17. Wir spekulieren, dass physikalische Eigenschaften, wie der flüssige oder feste Zustand von intraluminalen Inhalten, aufgrund der verschiedenen Kräfte, die sie an der GI-Wand erzeugen, verschiedene Mechanorezeptoren aktivieren müssen18.
Der Goldstandard für die Messung des In-vivo-GI-Transits beim Menschen wie bei Mäusen ist die Verwendung radioaktiver Tracer, die durch Szintigraphie gemessen werden, wenn sie den Magen verlassen oder entlang des Dickdarms19,20 gelangen. Bei Säugetieren schlingt sich der Dünndarm auf unvorhersehbare Weise, so dass der Dünndarm in vivo schwer zuverlässig abgebildet werden kann, aber es werden Fortschritte erzielt21. Darüber hinaus fehlen derzeit Werkzeuge, um zu quantifizieren, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Eigenschaften und Größen umgeht. Ausgangspunkt war hier eine Goldstandardtechnik, die die Untersuchung des Dünndarmtransits 22,23,24 und der Barrierefunktion 22 standardisiert. Es besteht darin, Mäuse mit einem fluoreszierenden Material zu glätten, auf die GI-Motilität zu warten, um das Material zu transportieren, den GI-Trakt zu entfernen, ihn in mehrere Abschnitte vom Magen zum Dickdarm zu segmentieren, intraluminale Inhalte zur Fluoreszenzquantifizierung zu schneiden und zu homogenisieren. Wir haben zwei Verbesserungen vorgenommen. Zuerst änderten wir die Zusammensetzung des gavaged Inhalts, um fluoreszierende mikroskopische Perlen einzubeziehen, um zu bestimmen, wie der Dünndarm physikalische Partikel verteilt. Zweitens verbesserten wir die räumliche Auflösung, indem wir den gesamten GI-Trakt vom Magen bis zum Dickdarm ex vivo abbildeten und Binning variabler Größe verwendeten, um unsere Analyse über Tiere hinweg zu standardisieren. Wir postulieren, dass dies neue Einblicke in das Gleichgewicht von propulsiven versus segmentierenden Kontraktionen während der postprandialen Phase liefert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>other mice can be used with this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for spreadsheet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g</td>
			<td>&#34;smaller beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g</td>
			<td>&#34;larger beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gavage needles</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-18-50-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to extract fluorescence profile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminated ruler paper (prepared in-house)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>r8881-100mg</td>
			<td>&#34;liquid&#34; condition in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates

Die gastrointestinale Motilität (GI) ist entscheidend für eine normale Verdauung und Resorption. Im Dünndarm, der Nährstoffe aufnimmt, optimiert die Motilität die Verdauung und Absorption. Aus diesem Grund umfassen einige der Motilitätsmuster im Dünndarm Segmentierung zum Mischen von luminalen Inhalten und Peristaltik für ihren Antrieb. Physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts modulieren die Muster der Dünndarmmotilität. Die mechanische Stimulation mechanosensorischer GI-Schaltkreise durch den Transit von luminalen Inhalten und der zugrunde liegenden Darmmotilität initiiert und moduliert komplexe GI-Motormuster. Die mechanosensorischen Mechanismen, die diesen Prozess antreiben, sind jedoch noch wenig verstanden. Dies ist vor allem auf einen Mangel an Werkzeugen zurückzuführen, um zu analysieren, wie der Dünndarm mit Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften umgeht. Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert. Wir gördern lebende Mäuse mit fluoreszierender Flüssigkeit oder winzigen fluoreszierenden Perlen. Nach 30 Minuten sezieren wir den Darm, um die Verteilung des fluoreszierenden Inhalts über den gesamten GI-Trakt abzubilden. Zusätzlich zu hochauflösenden Messungen des geometrischen Zentrums verwenden wir Binning variabler Größe und Spektralanalysen, um zu bestimmen, wie verschiedene Materialien den Dünndarmtransit beeinflussen. Wir haben untersucht, wie ein kürzlich entdeckter "Darmberührungsmechanismus" die Dünndarmmotilität mit diesem Ansatz beeinflusst.

Wir zeigen repräsentative Ergebnisse ab Schritt 3. Abbildung 1 zeigt den intakten explantierten Darm, wobei fluoreszierende Messungen überlagert sind. Der Magen (lila) liegt entlang der gleichen Achse wie der Dünndarm (orange), aber wir ziehen es vor, den Blinddarm (blau) zur Seite zu bewegen, um eine Überlappung mit dem Dickdarm (orange) zu vermeiden. Wie im linken Bild zu sehen ist, ist dies aufgrund der Organgröße nicht immer möglich. Wir schneiden den Dünndarm bei ~ 200 mm, um di...

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Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert.

Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Dies ist ein Protokoll, das untersucht, wie der Dünndarm mit Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften umgeht und wie er diese Materialien im Raum verteilt. Es ist ein ergänzendes Werkzeug in unserer Studie der Darmmechanosensitivität. Die Hauptvorteile dieses Protokolls bestehen darin, dass es verwendet werden kann, um Materialien oder Mischungen mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften zu untersuchen, und dass die Auflösung es uns ermöglicht, regionale Transite über kurze Darmsegmente aufzulösen.Diese Technik trägt zu unserem Verständnis der Darmmechanosensitivität bei. Es hilft uns zu verstehen, wie der Dünndarm Transitentscheidungen trifft, basierend auf den mechanischen Hinweisen, die er von den intraluminalen Inhalten erhält. Um zu beginnen, bereiten Sie die Sonde vor, indem Sie ein Zuführrohr von 18 Gauge Dicke und 50 Millimeter Länge an eine 1-Milliliter-Spritze anbringen und 200 Mikroliter RITC-Lösung oder Mikrokugellösung ziehen.Als nächstes halten Sie das nüchterne Tier manuell mit der einhändigen Rückhaltetechnik zurück und führen Sie dann die Ernährungssonde vorsichtig durch den Mund und die Speiseröhre der Maus ein, bis sie in den Magen gelangt. Nach dem Einführen den Spritzeninhalt langsam in den Magen ausstoßen und den Schlauch vorsichtig von der Maus entfernen. Nach dem Gavage, bringen Sie die Maus in den Käfig zurück.Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, schalten Sie das In-vivo-Bildgebungsinstrument ein, damit es die gewünschte Temperatur erreicht. Stellen Sie die Maus nach der Euthanasie in Rückenlage auf ein Sezierstadium und stecken Sie ihre vier Anhängsel auf die Bühne, um Zugang zum Bauch zu erhalten. Als nächstes befeuchten Sie die Oberfläche des Bauches mit 70% Ethanol.Als nächstes verwenden Sie Mikrodissektionszangen, um die Haut zu ziehen und einen Querschnitt mit einer scharfen chirurgischen Schere 1 Zentimeter über dem Anus zu machen. Um die intraperitoneale Höhle freizulegen, setzen Sie den Schnitt vertikal den Bauch hinauf bis zum Brustkorb fort. Behandeln Sie den Darm sanft und schätzen Sie seine Orientierung in der Bauchhöhle, bevor Sie ihn manipulieren.Schneiden Sie die proximale zur gastroösophagealen Verbindung, trennen Sie so den Magen von der Speiseröhre und entwirren Sie sanft den Dickdarm, den Blinddarm und den Dünndarm, indem Sie langsam in die entgegengesetzte Richtung ziehen. Verwenden Sie eine Mikrodissektionschere, um die Anhänge des Mesenteriums vom Darm zu trennen. Übertragen Sie später mit der Pinzette den sezierten Darm auf das Messblatt.Legen Sie den Magen auf 0 Millimeter und ordnen Sie den Darm entlang des Lineals bis 200 Millimeter an, schneiden Sie dann den Darm bei 200 Millimetern mit einer Mikrodissektionsschere und wiederholen Sie diesen Vorgang der Darmausrichtung. Sobald das Gewebe auf dem Lineal angeordnet ist, ordnen Sie den Blinddarm parallel zum Gewebe an, aber nicht in direktem Kontakt mit ihm. Legen Sie das Messblatt mit dem sezierten Gewebe in einen dunklen Bereich, damit die Fluoreszenz erhalten bleibt, bis es Zeit für die Aufnahme ist.Um die Ex-vivo-Bildgebung zu starten, öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Melden Sie sich an und initialisieren Sie das bildgebende Gerät, um für die Bildaufnahme bereit zu sein. Stellen Sie für RITC Gavage die Anregung auf 535 Nanometer und die Emissionen auf 600 Nanometer ein.Stellen Sie für grüne Mikrokugelperlen die Anregung auf 465 Nanometer und die Emission auf 520 Nanometer ein. Stellen Sie nun die Belichtung auf Auto und wählen Sie das Sichtfeld aus. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich der Darm während des Transports nicht verschoben hat, legen Sie das Messblatt innerhalb des Sichtfeldes in das Instrument.Schließen Sie die Tür zum Instrument sicher und wählen Sie Schnappschuss, um das Sichtfeld zu fotografieren. Speichern Sie die gesammelten Bilder zur Analyse auf einem Flash-Laufwerk. Als nächstes speichern Sie einzelne Aufnahmen der fluoreszierenden und fotografischen Bilder.Eine Überlagerung des Fotos und der Fluoreszenz zeigt die Lage von fluoreszierenden Materialien im Magen-Darm-Trakt an. Öffnen Sie die fluoreszierenden und fotografischen Bilddateien in der Bildbearbeitungssoftware zur Analyse. Passen Sie die Pixelgröße beider Bilder an, um die genauen Abmessungen zu erhalten, und schließen Sie die Fotodatei.Verwenden Sie für das fluoreszierende Bild ein Radiergummi, um den Hintergrund zu entfernen und transparent zu machen. Erstellen Sie einen neuen Layer. Wählen Sie eine schwarze Füllung für die Ebene und ziehen Sie die Ebene so, dass sie unter der Ebene mit dem fluoreszierenden Bild liegt, und erstellen Sie einen vollständig schwarzen Hintergrund.Speichern Sie das neue fluoreszierende Bild, das nur das fluoreszierende Signal auf schwarzem Hintergrund enthält, als neue TIF-Datei. Öffnen Sie die neuen fluoreszierenden und fotografieren Sie Bilder in ImageJ. Verwandeln Sie jedes Bild in ein 30-Bit-Bild, indem Sie Bild wählen, gefolgt von Typ und 30-Bit.Erstellen Sie ein zusammengeführtes Bild von beiden, indem Sie Bild und anschließend Farb- und Verschmelzungskanäle auswählen. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Dialogfeld die Fotodatei für den Graukanal und die Fluoreszenzdatei unter beliebigen farbigen Kanälen aus. Deaktivieren Sie die Skalierung des zusammengeführten Bildes, indem Sie Analysieren auswählen, gefolgt von Maßstab festlegen und Zum Entfernen der Skalierung klicken.Wählen Sie das Rechteck-Werkzeug in ImageJ aus. Zeichnen Sie ein Rechteck um einen Abschnitt des Dünndarms und achten Sie dabei genau auf die Breite dieser Region von Interesse, da sie zwischen allen interessierenden Regionen konstant bleiben sollte. Duplizieren Sie den gewünschten Bereich, indem Sie Bild auswählen, gefolgt von Duplizieren und nur den Kanal auswählen, der dem farbigen Kanal entspricht.Verwenden Sie erneut das Rechteck-Werkzeug, um einen Bereich von Interesse über das gesamte neue Bild zu zeichnen und ein Fluoreszenzprofil abzurufen, indem Sie Analysieren und anschließend Plotprofil auswählen. Öffnen Sie die Liste der Werte und kopieren Sie sie in eine Tabellenkalkulationssoftware. Wiederholen Sie die Schritte vom Zeichnen des interessierenden Bereichs bis zum Abrufen eines Fluoreszenzprofils für jeden Abschnitt des Dünndarms, wie zuvor in einer anderen Linealreihe beschrieben.Multiplizieren Sie in der Tabellenkalkulationssoftware jeden durchschnittlichen Intensitätswert mit der konstanten Breite des im vorherigen Schritt erstellten Rechtecks für den interessierenden Bereich. Dies ergibt den tatsächlichen Intensitätswert entlang des Dünndarms an jedem Punkt. Hier sind die durchschnittlichen Fluoreszenzspuren entlang der Länge des Dünndarms dargestellt.Die Verteilung von fluoreszierendem Material variiert je nach Materialeigenschaften der intraluminalen Inhalte. Die Erhöhung der Anzahl der Bins, die zum Sortieren derselben Rohdatensätze verwendet werden, zeigt granulare Trace-Features, die mit weniger Bins nicht aufgelöst werden können. Kleinere Bins verringern die Messunsicherheit, erhöhen die räumliche Auflösung und spiegeln die distributive Komponente der Dünndarmmotilität besser wider.Das geometrische Zentrum kann die räumliche Verteilung der intraluminalen Inhalte nicht vollständig charakterisieren. Diese Einschränkung der geometrischen Mittenmessung zeigt sich im Vergleich zwischen Flüssigkeiten und größeren Perlen. Die fluoreszierende Spur der größeren Perlen ist stärker verteilt, aber sie mittelt sich auf einen ähnlichen Punkt wie die der Flüssigkeit, unabhängig von der Binning-Granularität, was die Einschränkung der ausschließlichen Fokussierung auf das geometrische Zentrum unterstreicht.Um die distributive Natur von Dünndarmkontraktionen zu berücksichtigen, wurde eine Leistungsspektralanalyse in die vorliegende Studie aufgenommen. Die Darstellung des Leistungsspektrums zeigt, dass wir bei schrumpfenden Bin-Größen signifikant dominante Frequenzen im größeren Perlenspektrum beobachten können, aber nicht in dem der kleinen Perlen. Einige, aber nicht alle dieser zusätzlichen dominanten Frequenzen sind im Flüssigkeitsspektrum vorhanden.Die heikelsten Schritte dieses Protokolls sind die Sonde und die Dissektion. Diese sollten von den Experimentatoren standardisiert werden, bevor diese Technik zu Versuchszwecken durchgeführt wird. Dies ist ein terminales Experiment, da das Tier geopfert werden muss.Wenn möglich, maximieren Sie die Verwendung Ihres Tiermodells, indem Sie vor diesem andere nicht-terminale Experimente durchführen. Unsere Gruppe hat diese Technik kürzlich verwendet, um unsere Entdeckung von Darm-Touch-Sets zu unterstützen, bei denen der Darm epitheliale Mechanorezeptoren verwendet, um feinere physikalische Eigenschaften zu erfassen, ähnlich wie unsere Finger.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

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Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Forschung

Medizin

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Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

DNBS / TNBS Colitis-Modelle: Einblicke in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Effekte von Nahrungsfett

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

Murine Ileocolic Bowel Resection with Primary Anastomosis

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Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

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This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

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Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion humaner mesenchymaler Stammzellen Homing in den Darm zur Verwendung in murinen Modellen von experimentellen entzündlichen Darmerkrankungen erhöhen

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In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

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