Name: studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00
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管理支援を提供してくれたリンジー・バズビー夫人とメディア支援をしてくれたジョエル・ピノ氏に感謝します。NIHの助成金はこの研究を支援しました:DK123549、AT010875、DK052766、DK128913、および消化器病学における細胞シグナル伝達のためのメイヨークリニックセンター(DK084567)。

ここに記載されているすべての方法は、メイヨークリニックの施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. セットアップ
<ol><li>8〜10週齢のマウスを4時間高速にします。マウスに水へのアクセスを提供します。 注:ここに示されているすべての実験には野生型の雄C57BL / 6Jマウスを使用していますが、系統、性別、遺伝子型のマウスで実行?...

<ol>
	<li>Stevens, C. E., Hume, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , (2004).</li><li>Bayliss, W. M., Starling, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movements+and+innervation+of+the+small+intestine.">The movements and innervation of the small intestine.</a> The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).</li><li>Husebye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patterns+of+small+bowel+motility:+physiology+and+implications+in+organic+disease+and+functional+disorders.">The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders.</a> Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).</li><li>Bush, T. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+cells+of+Cajal+mediate+mechanosensitive+responses+in+the+stomach.">Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).</li><li>Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+myenteric+sensory+neurons+in+the+mouse+small+intestine.">Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).</li><li>McIntyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bran,+ispaghula,+and+inert+plastic+particles+on+gastric+emptying+and+small+bowel+transit+in+humans:+the+role+of+physical+factors.">Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors.</a> Gut. 40 (2), 223-227 (1997).</li><li>Treichel, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+abdominal+autofluorescence+detected+by+in+vivo+fluorescence+imaging+of+living+mice.">Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice.</a> Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).</li><li>Szarka, L. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+discrimination+in+rat+and+mouse+gastric+emptying.">Size discrimination in rat and mouse gastric emptying.</a> Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).</li><li>Zhu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+sensory+neurons+communicate+with+interstitial+cells+of+Cajal+to+affect+pacemaker+activity+in+the+small+intestine.">Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).</li><li>Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+touchy+business+of+gastrointestinal+(GI)+mechanosensitivity.">The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity.</a> Brain Research. 1693, 197-200 (2018).</li></ol>

消化管は、血管などの他の管状器官と同様に、恒常性を維持するために機械的センサーとエフェクターを必要とします26、27、28。ただし、消化管は、消化管を横断する材料の物理的特性が食事全体で一定ではないという点で独特です。さまざまな物理的特性(固体、液体、気体)の管腔内内容物が腸を通過し、GI機械受容器?...

ヒトの胃腸(GI)管は、長さ数フィートの臓器系であり、さまざまな寸法と物理的特性のチューブとして大まかに近似されます1。内容物がその長さを移動するにつれて、消化管の主な機能は生命にとって重要な物質を吸収することです。小腸は特に栄養素の吸収に関与しています。小腸の通過は、消化および吸収機能に一致するように厳密に制御されており、さまざまな運動パターンをもたらします。ベイリスとスターリングは、1899年に「腸の法則」2について説明し、今日蠕動反射として知られている腸内の収縮推進プログラムを示しました。食物ボーラスの近位のセグメントはそれを前方に推進するために収縮し、遠位セグメントはそれを受け取るために弛緩します。理論的には、このパターンだけで材料をボラルに輸送するのに十分である可能性がありますが、1世紀以上の研究により、消化管の収縮活動のより複雑な絵が描かれてきました。ヒトでは、移動運動複合体(MMC)、絶食期、食後期間の3つの小腸運動期間が認められています3。同じパターンがマウス4,5でも報告されています。MMCは、ほとんどの哺乳類で保存されている周期的な運動パターンです6,7。MMCは、機能性GI障害7において有用な臨床マーカーとして機能する特徴的な4相パターンを有する。4つのフェーズは、発生順に、(I)静止、(II)不規則で低振幅の収縮、(III)規則的な高振幅の収縮、および(IV)活動の低下のランプダウン期間です7。MMCは、断食期間3の主要な運動パターンを示します。絶食期のMMCは、次の食事に備えて小腸の内容物を片付けます。
食後の運動パターンは、消化機能と吸収機能に最適化されています3。カロリー組成に関係なく、最初の通過は小腸に沿って速く、内容物は腸の長さに沿って広がり、その後の通過は遅くなります8。吸収は、接触表面積を増やし、それを遅くして滞留時間を増やすことによって最適化されます。栄養素が内腔内に入ると、支配的なパターンは、緊密な(<2 cm離れた)協調性のない収縮(セグメント収縮)で構成され、小腸の全長にまたがるいくつかの重ねられた大振幅の収縮(蠕動収縮)9。セグメント化収縮は、管腔内内容物を所定の位置に混合する。時折の大きな蠕動収縮は、内容物を結腸に向かって推進します。
MMCへのこの移行のタイミングは、食物量とカロリー組成に依存します10。したがって、小腸は管腔の手がかりをサンプリングして、運動期間間の移行時期を調節します。管腔内容物11の物理的性質、管腔容積、および壁張力などの機械的手がかりは、GI壁12、13、14、15、16の機械受容器細胞を関与させる。実際、食事の固形成分を増やすと、小腸通過が増加します17。我々は、管腔内内容物の液体または固体状態などの物理的特性は、それらがGI壁18に生成する様々な力のために、異なる機械受容器と交戦しなければならないと推測する。
マウスと同様に、ヒトのin vivoGIトランジットを測定するためのゴールドスタンダードは、胃を出るとき、または結腸に沿って通過するときにシンチグラフィーによって測定された放射性トレーサーの使用です19,20。哺乳類では、小腸は予測不可能な方法でループするため、小腸をin vivoで確実に画像化することは困難ですが、進歩が見られます21。さらに、現在、小腸がさまざまな特性とサイズの微粒子をどのように処理するかを定量化するためのツールが不足しています。ここでの出発点は、小腸通過22,23,24とバリア機能22の研究を標準化するゴールドスタンダードの技術でした。これは、蛍光材料でマウスを経管し、GI運動性が物質を輸送するのを待ち、消化管を切除し、胃から結腸までのいくつかのセクションに分割し、切片化し、蛍光定量のために管腔内内容物を均質化することで構成されます。2 つの改善を行いました。まず、小腸が物理的な粒子をどのように分布させるかを決定するために、経管栄養内容物の構成を変更して蛍光顕微鏡ビーズを含めました。次に、胃から結腸までの消化管全体をex vivoでイメージングすることで空間分解能を改善し、可変サイズビニングを使用して動物全体の分析を標準化しました。これにより、食後の段階における推進収縮とセグメント化収縮のバランスに関する新しい洞察が明らかになったと仮定します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>other mice can be used with this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for spreadsheet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g</td>
			<td>&#34;smaller beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g</td>
			<td>&#34;larger beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gavage needles</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-18-50-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to extract fluorescence profile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminated ruler paper (prepared in-house)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>r8881-100mg</td>
			<td>&#34;liquid&#34; condition in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates

胃腸(GI)の運動性は、正常な消化と吸収にとって重要です。栄養素を吸収する小腸では、運動性が消化と吸収を最適化します。このため、小腸の運動パターンには、管腔内容物を混合するためのセグメンテーションと、それらの推進のための蠕動運動が含まれます。管腔内容物の物理的性質は、小腸の運動性のパターンを調節する。管腔内容物とその根底にある腸の運動性をトランジットすることによるGI機械感覚回路の機械的刺激は、複雑なGI運動パターンを開始および調節します。しかし、このプロセスを推進する機械感覚メカニズムは、まだよくわかっていません。これは主に、小腸が異なる物理的特性の材料をどのように扱うかを解剖するためのツールが不足しているためです。小腸がさまざまなサイズの微粒子をどのように処理するかを研究するために、私たちは確立された in vivo 法を修正して小腸通過を決定しました。生きたマウスに蛍光液体または微小な蛍光ビーズを経管投与します。30分後、腸を解剖して、消化管全体にわたる蛍光成分の分布を画像化します。幾何学的中心の高分解能測定に加えて、可変サイズビニングとスペクトル分析を使用して、さまざまな材料が小腸輸送にどのように影響するかを判断します。最近発見された「腸のタッチ」メカニズムが、このアプローチを使用して小腸の運動性にどのように影響するかを調べました。

ステップ3以降の代表的な成果を示す。 図1 は、無傷の外植腸を示し、蛍光測定値を重ね合わせた。胃(紫色)は小腸(オレンジ)と同じ軸に沿って置かれていますが、大腸(オレンジ)との重なりを防ぐために盲腸(青)を横に動かすことを好みます。左のパネルで証明されているように、これは臓器のサイズのために常に可能であるとは限りません。小腸を~200mmで切断し、連続?...

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Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

小腸がさまざまなサイズの微粒子をどのように処理するかを研究するために、私たちは確立された in vivo 法を修正して小腸通過を決定しました。

管腔微粒子のマウス小腸メカノセンシングの研究

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

これは、小腸がさまざまな物理的性質の材料をどのように扱い、それらの物質を空間にどのように分配するかを研究するプロトコルです。これは、腸の機械感受性の研究における補完的なツールです。このプロトコルの主な利点は、異なる物理的特性を持つ材料または混合物の研究に使用できること、および分解能により、短い腸セグメントにわたる局所的な通過を解決できることです。この手法は、腸の機械感受性の理解を深めます。これは、小腸が管腔内内容物から受け取る機械的手がかりに基づいてどのように通過決定を行うかを理解するのに役立ちます。まず、厚さ18ゲージ、長さ50ミリメートルの栄養チューブを1ミリリットルのシリンジに取り付け、200マイクロリットルのRITC溶液またはマイクロスフェア溶液を吸引して、経管栄養を準備します。次に、片手拘束技術を使用して絶食した動物を手動で拘束し、次にマウスの口と食道から胃に入るまで栄養チューブを静かに挿入します。挿入したら、シリンジの内容物をゆっくりと胃の中に排出し、マウスからチューブを慎重に取り外します。経管栄養の後、マウスをケージに戻します。解剖を開始する前に、in vivoイメージング機器の電源を入れて、目的の温度に到達します。安楽死後、マウスを解剖ステージの仰臥位に置き、その4つの付属肢をステージに固定して腹部にアクセスします。次に、腹部の表面を70%エタノールで濡らします。次に、微小解剖鉗子を使用して皮膚を引っ張り、肛門の1センチ上の鋭利な外科用ハサミを使用して横切開を行います。腹腔を露出させるには、胸郭まで腹部を垂直に切開し続けます。腸を優しく扱い、操作する前に腹腔内での向きを理解してください。胃食道接合部への近位を切断し、胃を食道から分離し、反対方向にゆっくりと引っ張って結腸、盲腸、小腸を静かに解きます。マイクロ解剖はさみを使用して、腸間膜の腸への付着を分離します。その後、鉗子を使用して、解剖した腸を測定シートに移します。胃を0ミリメートルに置き、定規に沿って腸を200ミリメートルまで配置してから、マイクロ解剖ハサミで腸を200ミリメートルで切断し、腸の位置合わせのこの手順を繰り返します。組織が定規に配置されたら、盲腸を組織と平行に配置しますが、直接接触しないようにします。解剖した組織を含む測定シートを暗い領域に置いて、画像化する時間になるまで蛍光を保存できるようにします。ex vivoイメージングを開始するには、イメージングソフトウェアを開きます。ログインして撮像装置を初期化し、画像取得の準備をします。RITC経管栄養の場合は、励起を535ナノメートル、放射を600ナノメートルに設定します。一方、緑色のミクロスフェアビーズの場合は、[励起]を465ナノメートル、[発光]を520ナノメートルに設定します。次に、露出を自動に設定し、視野を選択します。輸送中に腸がずれていないことを確認した後、測定シートを視野内の機器に配置します。機器のドアをしっかりと閉め、[スナップショット]を選択して視野を撮影します。収集した画像を分析のためにフラッシュドライブに保存します。次に、蛍光画像と写真画像の個々のキャプチャを保存します。写真と蛍光のオーバーレイは、胃腸管内の蛍光物質の位置を示します。蛍光灯と写真の画像ファイルを画像編集ソフトウェアで開いて分析します。両方の画像のピクセルサイズを調整して正確なサイズにし、写真ファイルを閉じます。蛍光画像の場合は、消しゴムツールを使用して背景を削除し、透明にします。新しいレイヤーを作成します。レイヤーの黒の塗りつぶしを選択し、レイヤーをドラッグして蛍光画像のあるレイヤーの下に置き、完全に黒い背景を作成します。黒い背景に蛍光シグナルのみを含む新しい蛍光画像を新しいTIFファイルとして保存します。ImageJで新しい蛍光画像と写真画像を開きます。各画像を 30 ビット イメージに変換するには、[イメージ]、[種類]、[30 ビット] の順に選択します。両方の結合画像を作成するには、「画像」を選択してから、「カラー」と「チャンネルを結合」を選択します。開いたダイアログボックスで、灰色チャンネルの写真ファイルと蛍光ファイルを選択します 任意の色チャンネルの下.結合された画像のスケールをオフにするには、[分析]、[スケールの設定]、[クリックしてスケールの削除]の順に選択します。ImageJ の長方形ツールを選択します。小腸の一部の周りに長方形を描きながら、この関心領域の幅に細心の注意を払います, すべての関心領域間で一定に保たれる必要があるため.「画像」、「複製」の順に選択して、対象領域を複製し、色付きのチャンネルに対応するチャンネルのみを選択します。ここでも、長方形ツールを使用して、新しい画像全体に関心領域を描画し、分析を選択してからプロファイルをプロットして蛍光プロファイルを取得します。値のリストを開き、スプレッドシートソフトウェアにコピーします。関心領域の描画から、小腸の各セクションの蛍光プロファイルの取得までの手順を繰り返します(別の定規の行で前述したとおり)。スプレッドシートソフトウェアで、各平均強度値に、前の手順で作成した関心領域の長方形の一定の幅を掛けます。これにより、各ポイントの小腸に沿った実際の強度値が得られます。ここに示されているのは、小腸の長さに沿った平均蛍光トレースです。蛍光物質の分布は、管腔内内容物の材料特性によって異なります。同じ生データセットのソートに使用されるビンの数を増やすと、ビンの数が少ないと解決できない詳細なトレース機能が表示されます。ビンが小さいほど、測定の不確実性が低下し、空間分解能が向上し、小腸の運動性の分布成分をよりよく反映します。幾何学的中心は、管腔内内容物の空間分布を完全に特徴付けることができない。幾何学的中心測定のこの制限は、液体とより大きなビーズの比較で明らかです。大きなビーズの蛍光トレースはより分布していますが、ビニングの粒度に関係なく、液体の蛍光トレースと同様のポイントまで平均化されるため、幾何学的中心のみに焦点を当てることの限界が浮き彫りになります。小腸収縮の分布性を説明するために、パワースペクトル分析が本研究に組み込まれました。パワースペクトルをプロットすると、ビンサイズが小さくなるにつれて、大きなビーズスペクトルでは有意に支配的な周波数を観測できますが、小さなビーズのスペクトルでは観察できないことがわかります。これらの追加の支配的な周波数のすべてではありませんが、一部が液体スペクトルに存在します。このプロトコルの最もデリケートなステップは、経管栄養と解剖です。これらは、実験目的でこの手法を実行する前に、実験者によって標準化されるべきである。動物を犠牲にする必要があるので、これは最終実験です。可能であれば、この実験の前に他の非終末実験を実行して、動物モデルを最大限に活用してください。私たちのグループは最近、この技術を使用して、腸が上皮機械受容器を使用して、指と同じようにより細かい物理的特性を感知する腸タッチセットの発見をサポートしています。

Research

JoVE Journal

Medicine

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小動物陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影における連続的な血液サンプリングにより、動脈入力機能の測定が可能

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