Name: studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates at JoVE.com

Agradecemos à Sra. Lyndsay Busby pela assistência administrativa e ao Sr. Joel Pino pelo apoio da mídia. As subvenções do NIH apoiaram este trabalho: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 e Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Mayo Clinic.
1. Configuração
<ol><li>Ratos rápidos de 8 a 10 semanas de idade por 4 h. Forneça aos ratos acesso à água. NOTA: Usamos camundongos machos C57BL/6J do tipo selvagem para todos os experimentos apresentados aqui, mas eles podem ser realizados em camundongos de qualquer cepa, gênero e genótipo.</li>
	<li>Arrefecer 15 ml de água destilada n...

<ol>
	<li>Stevens, C. E., Hume, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , (2004).</li><li>Bayliss, W. M., Starling, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movements+and+innervation+of+the+small+intestine.">The movements and innervation of the small intestine.</a> The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).</li><li>Husebye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patterns+of+small+bowel+motility:+physiology+and+implications+in+organic+disease+and+functional+disorders.">The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders.</a> Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).</li><li>Bush, T. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+migrating+electric+complex+of+the+canine+small+intestine.">A migrating electric complex of the canine small intestine.</a> American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).</li><li>Deloose, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migrating+motor+complex:+control+mechanisms+and+its+role+in+health+and+disease.">The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).</li><li>Johansoon, C., Ekelund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+body+weight+and+the+gastric+and+intestinal+handling+of+an+oral+caloric+load.">Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load.</a> Gut. 17, 456-462 (1976).</li><li>Sarna, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+human+jejunal+contractions.">Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions.</a> American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).</li><li>Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+ofcanine+postprandial+upper+gastrointestinal+motility.">Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility.</a> American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).</li><li>Mayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+feelings:+the+emerging+biology+of+gut-brain+communication.">Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).</li><li>Alcaino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+gut+epithelial+enterochromaffin+cells+is+mechanosensitive+and+requires+Piezo2+to+convert+force+into+serotonin+release.">A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).</li><li>Kugler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+activates+neurites+and+somata+of+myenteric+neurons.">Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).</li><li>Mazzuoli, G., Schemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+enteric+neurons+in+the+myenteric+plexus+of+the+mouse+intestine.">Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine.</a> PloS One. 7 (7), 39887 (2012).</li><li>Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+cells+of+Cajal+mediate+mechanosensitive+responses+in+the+stomach.">Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).</li><li>Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+myenteric+sensory+neurons+in+the+mouse+small+intestine.">Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).</li><li>McIntyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bran,+ispaghula,+and+inert+plastic+particles+on+gastric+emptying+and+small+bowel+transit+in+humans:+the+role+of+physical+factors.">Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors.</a> Gut. 40 (2), 223-227 (1997).</li><li>Treichel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+mechanosensory+epithelial+cells+in+mouse+gut+intrinsic+tactile+sensitivity.">Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity.</a> Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).</li><li>Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+movement+with+evaluating+colonic+transit+in+humans.">More movement with evaluating colonic transit in humans.</a> Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).</li><li>Camilleri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastric+emptying+and+colonic+filling+of+solids+characterized+by+a+new+method.">Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method.</a> American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-illumination+intestine+projection+imaging+of+intestinal+motility+in+mice.">Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).</li><li>Woting, A., Blaut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+intestinal+permeability+and+gut-transit+time+determined+with+low+and+high+molecular+weight+fluorescein+isothiocyanate-dextrans+in+C3H+mice.">Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice.</a> Nutrients. 10 (6), 685 (2018).</li><li>Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurement+of+intestinal+transit+in+the+rat.">Accurate measurement of intestinal transit in the rat.</a> The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).</li><li>Moore, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+carbon+monoxide+suppresses+the+development+of+postoperative+ileus+in+the+murine+small+intestine.">Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine.</a> Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Baeyens, N., Schwartz, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mechanotransduction+on+vascular+smooth+muscle+myocytes'+cytoskeleton+and+contractile+function.">The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).</li><li>Mercado-Perez, A., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+feelings:+mechanosensing+in+the+gastrointestinal+tract.">Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. , 1-14 (2022).</li><li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+abdominal+autofluorescence+detected+by+in+vivo+fluorescence+imaging+of+living+mice.">Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice.</a> Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).</li><li>Szarka, L. A., Camilleri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+assessment+of+small-bowel+and+colonic+transit.">Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).</li><li>Padmanabhan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+transit+measurements+in+mice+with+99mTc-DTPA-labeled+activated+charcoal+using+NanoSPECT-CT.">Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).</li><li>Jang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+discrimination+in+rat+and+mouse+gastric+emptying.">Size discrimination in rat and mouse gastric emptying.</a> Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).</li><li>Zhu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+sensory+neurons+communicate+with+interstitial+cells+of+Cajal+to+affect+pacemaker+activity+in+the+small+intestine.">Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).</li><li>Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+touchy+business+of+gastrointestinal+(GI)+mechanosensitivity.">The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity.</a> Brain Research. 1693, 197-200 (2018).</li></ol>

O trato gastrointestinal, assim como outros órgãos tubulares, como os vasos sanguíneos, necessita de sensores mecânicos e efetores para manter a homeostase26,27,28. No entanto, o trato gastrointestinal é único na medida em que as propriedades físicas dos materiais que o atravessam não são constantes entre as refeições. Conteúdos intraluminais de várias propriedades físicas (sólido, líquido e gasoso) transitam pel...

O trato gastrointestinal (GI) humano é um sistema de órgãos de vários metros de comprimento, aproximadamente aproximado como um tubo de diferentes dimensões e propriedades físicas1. À medida que o conteúdo se move através de seu comprimento, a principal função do trato gastrointestinal é absorver substâncias críticas para a vida. O intestino delgado é especificamente responsável pela absorção de nutrientes. O trânsito do intestino delgado é rigidamente regulado para combinar com as funções de digestão e absorção, resultando em vários padrões de motilidade. Bayliss e Starling descreveram a "lei do intestino"2 em 1899, mostrando o programa de propulsão contrátil no intestino conhecido hoje como reflexo peristáltico; o segmento proximal ao bolo alimentar se contrai para impulsioná-lo para a frente, e o segmento distal relaxa para recebê-lo. Em teoria, esse padrão por si só poderia ser suficiente para transportar material aboricamente, mas mais de um século de pesquisa pintou um quadro mais complexo da atividade contrátil no trato gastrointestinal. Três períodos de motilidade do intestino delgado são reconhecidos em humanos: o complexo motor migratório (MMC), o período de jejum e o período pós-prandial3. Os mesmos padrões foram relatados em camundongos 4,5. A MMC é um padrão motor cíclico conservado na maioria dos mamíferos 6,7. A MMC tem um padrão característico de quatro fases que serve como um marcador clínico útil nos distúrbios gastrointestinais funcionais7. As quatro fases, em ordem de ocorrência, são (I) quiescência, (II) contrações irregulares e de baixa amplitude, (III) contrações regulares de alta amplitude e (IV) período de rampa para baixo de atividade declinante7. O MMC marca o principal padrão motor do período de jejum3. MMCs do período de jejum limpar o conteúdo do intestino delgado em preparação para a próxima refeição.
Os padrões motores do período pós-prandial são otimizados para as funções digestiva e absortiva3. Independentemente da composição calórica, o trânsito inicial é rápido ao longo do intestino delgado, o conteúdo é espalhado ao longo do comprimento do intestino e, posteriormente, o trânsito diminui8. A absorção é otimizada aumentando a área de superfície de contato e retardando-a para aumentar o tempo de residência. Uma vez que os nutrientes estão dentro do lúmen, o padrão dominante consiste em contrações descoordenadas próximas (<2 cm de distância) (contrações segmentadoras), com algumas contrações sobrepostas de grande amplitude abrangendo toda a extensão do intestino delgado (contrações peristálticas)9. As contrações segmentantes misturam o conteúdo intraluminal no lugar. As grandes contrações peristálticas ocasionais impulsionam o conteúdo em direção ao cólon.
O momento dessa transição de volta aos MMCs depende do volume de alimentos e da composição calórica10. Assim, o intestino delgado amostras pistas luminais para regular quando a transição entre os períodos de motilidade. Pistas mecânicas, como propriedades físicas do conteúdo luminal11, volume luminal e tensão da parede, envolvem células mecanorreceptoras na parede gastrointestinal 12,13,14,15,16. De fato, o aumento do componente sólido de uma refeição leva a um aumento no trânsito do intestino delgado17. Especulamos que propriedades físicas, como o estado líquido ou sólido dos conteúdos intraluminais, devem envolver diferentes mecanorreceptores devido às várias forças que geram na parede gastrointestinal18.
O padrão-ouro para medir o trânsito gastrointestinal in vivo em humanos, como em camundongos, é o uso de marcadores radioativos medidos por cintilografia à medida que saem do estômago ou transitam ao longo do cólon19,20. Em mamíferos, o intestino delgado circula de maneiras imprevisíveis, tornando o intestino delgado difícil de visualizar in vivo de forma confiável, mas o progresso está sendo feito21. Além disso, atualmente há uma falta de ferramentas para quantificar como o intestino delgado lida com partículas de propriedades e tamanhos variados. O ponto de partida aqui foi uma técnica padrão-ouro que padroniza o estudo do trânsito do intestino delgado 22,23,24 e da função de barreira 22. Consiste em gavagar camundongos com material fluorescente, aguardar a motilidade gastrointestinal para transportar o material, excisar o trato gastrointestinal, segmentá-lo em várias seções do estômago ao cólon, seccionar e homogeneizar o conteúdo intraluminal para quantificação da fluorescência. Fizemos duas melhorias. Primeiro, alteramos a composição do conteúdo gavado para incluir contas microscópicas fluorescentes para determinar como o intestino delgado distribui partículas físicas. Em segundo lugar, melhoramos a resolução espacial ao visualizar todo o trato gastrointestinal, do estômago ao cólon, ex vivo e usamos binning de tamanho variável para padronizar nossa análise entre os animais. Postulamos que isso revela novos insights sobre o equilíbrio das contrações propulsivas versus segmentadoras durante a fase pós-prandial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>other mice can be used with this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for spreadsheet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g</td>
			<td>&#34;smaller beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g</td>
			<td>&#34;larger beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gavage needles</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-18-50-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to extract fluorescence profile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminated ruler paper (prepared in-house)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>r8881-100mg</td>
			<td>&#34;liquid&#34; condition in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates

A motilidade gastrointestinal (GI) é fundamental para a digestão e absorção normais. No intestino delgado, que absorve nutrientes, a motilidade otimiza a digestão e a absorção. Por esta razão, alguns dos padrões de motilidade no intestino delgado incluem segmentação para mistura de conteúdo luminal e peristaltismo para sua propulsão. As propriedades físicas do conteúdo luminal modulam os padrões de motilidade do intestino delgado. A estimulação mecânica dos circuitos mecanossensoriais gastrointestinais pelo conteúdo luminal em trânsito e pela motilidade intestinal subjacente inicia e modula padrões motores GI complexos. No entanto, os mecanismos mecanossensoriais que impulsionam esse processo permanecem pouco compreendidos. Isto é principalmente devido à falta de ferramentas para dissecar como o intestino delgado lida com materiais de diferentes propriedades físicas. Para estudar como o intestino delgado lida com partículas de tamanhos variados, modificamos um método estabelecido in vivo para determinar o trânsito do intestino delgado. Nós gavagamos ratos vivos com líquido fluorescente ou minúsculas contas fluorescentes. Após 30 minutos, dissecamos os intestinos para obter imagens da distribuição do conteúdo fluorescente em toda a totalidade do trato gastrointestinal. Além das medições de alta resolução do centro geométrico, usamos binning de tamanho variável e análise espectral para determinar como diferentes materiais afetam o trânsito do intestino delgado. Exploramos como um mecanismo de "toque intestinal" recentemente descoberto afeta a motilidade do intestino delgado usando essa abordagem.

Mostramos resultados representativos a partir do Passo 3 em diante. A Figura 1 mostra os intestinos explantados intactos, com medidas fluorescentes sobrepostas. O estômago (roxo) é colocado ao longo do mesmo eixo que o intestino delgado (laranja), mas preferimos mover o ceco (azul) para o lado para evitar a sobreposição com o intestino grosso (laranja). Como evidenciado no painel esquerdo, isso nem sempre é possível devido ao tamanho do órgão. Cortamos o intestino delgado a ~200 mm p...

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Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

Para estudar como o intestino delgado lida com partículas de tamanhos variados, modificamos um método estabelecido in vivo para determinar o trânsito do intestino delgado.

Estudando o Mecananosense do Intestino Delgado Urinário de Partículas Luminais

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Este é um protocolo que estuda como o intestino delgado lida com materiais de diferentes propriedades físicas e como distribui esses materiais no espaço. É uma ferramenta complementar em nosso estudo da mecanossensibilidade intestinal. As principais vantagens deste protocolo são que ele pode ser usado para estudar materiais ou misturas com diferentes propriedades físicas e que a resolução nos permite resolver trânsitos regionais em segmentos intestinais curtos.Esta técnica contribui para a nossa compreensão da mecanossensibilidade intestinal. Isso nos ajuda a entender como o intestino delgado toma decisões de trânsito com base nas pistas mecânicas que recebe do conteúdo intraluminal. Para começar, prepare a gavagem anexando um tubo de alimentação de espessura de calibre 18 e comprimento de 50 milímetros a uma seringa de 1 mililitro e desenhando 200 microlitros de solução RITC ou solução de microesfera.Em seguida, restrinja manualmente o animal em jejum usando a técnica de contenção com uma mão e, em seguida, insira suavemente o tubo de alimentação através da boca e do esôfago do rato até que ele entre no estômago. Uma vez inserido, expulse lentamente o conteúdo da seringa para o estômago e remova cuidadosamente o tubo do rato. Após a gavagem, devolva o rato à gaiola.Antes de iniciar as dissecções, ligue o instrumento de imagem in vivo para que ele atinja a temperatura desejada. Após a eutanásia, coloque o rato em decúbito dorsal em estágio de dissecção e fixe seus quatro apêndices no palco para acessar o abdômen. Em seguida, molhe a superfície do abdômen com etanol a 70%.Em seguida, use pinça de micro-dissecção para puxar a pele e fazer uma incisão transversal usando tesoura cirúrgica afiada 1 centímetro acima do ânus. Para expor a cavidade intraperitoneal, continue a incisão verticalmente até o abdômen até a caixa torácica. Manuseie suavemente os intestinos e aprecie sua orientação na cavidade abdominal antes de manipulá-los.Corte o proximal à junção gastroesofágica, separando assim o estômago do esôfago e desvende suavemente o cólon, o ceco e o intestino delgado, puxando lentamente na direção oposta. Use uma tesoura de microdissecação para separar os anexos do mesentério aos intestinos. Mais tarde, usando a pinça, transfira os intestinos dissecados para a folha de medição.Coloque o estômago a 0 milímetros e organize os intestinos ao longo da régua até 200 milímetros, em seguida, corte o intestino a 200 milímetros com tesoura de micro-dissecção e repita este procedimento de alinhamento intestinal. Uma vez que o tecido esteja disposto na régua, organize o ceco em paralelo com o tecido, mas não em contato direto com ele. Coloque a folha de medição com o tecido dissecado em uma área escura para que a fluorescência possa ser preservada até a hora da imagem.Para iniciar a geração de imagens ex vivo, abra o software de imagem. Faça login e inicialize o instrumento de imagem para estar pronto para a aquisição de imagens. Para gavagem RITC, defina Excitação em 535 nanômetros e Emissões, 600 nanômetros.Enquanto para contas de microesferas verdes, defina Excitação em 465 nanômetros e Emissão em 520 nanômetros. Agora, defina a exposição como Auto e selecione o campo de visão. Depois de garantir que os intestinos não se deslocaram durante o transporte, coloque a folha de medição no instrumento dentro do campo de visão.Feche com segurança a porta do instrumento e selecione Instantâneo para fotografar o campo de visão. Salve as imagens coletadas em uma unidade flash para análise. Em seguida, salve capturas individuais das imagens fluorescentes e fotográficas.Uma sobreposição da fotografia e fluorescência indica a localização de materiais fluorescentes no trato gastrointestinal. Abra os arquivos de imagem fluorescentes e de fotografia no software de edição de imagens para análise. Ajuste o tamanho do pixel de ambas as imagens para ter as dimensões exatas e feche o arquivo de fotografia.Para a imagem fluorescente, use uma ferramenta de borracha para remover o plano de fundo e torná-lo transparente. Crie uma nova camada. Escolha um preenchimento preto para a camada e arraste a camada para ficar abaixo da camada com a imagem fluorescente e faça um fundo totalmente preto.Salve a nova imagem fluorescente que contém apenas o sinal fluorescente em um fundo preto como um novo arquivo TIF. Abra as novas imagens fluorescentes e fotográficas no ImageJ. Transforme cada imagem em uma imagem de 30 bits escolhendo Imagem, seguida de Tipo e 30 bits.Crie uma imagem mesclada de ambos escolhendo Imagem, seguida por Cores e Mesclar canais. Na caixa de diálogo que é aberta, selecione o arquivo de fotografia para o canal cinza e o arquivo fluorescente Sob quaisquer canais coloridos. Desative a escala da imagem mesclada selecionando Analisar, seguido de Definir escala e Clique para remover escala.Selecione a ferramenta Retângulo no ImageJ. Desenhe um retângulo em torno de uma seção do intestino delgado, prestando muita atenção à largura dessa região de interesse, pois ela deve permanecer constante entre todas as regiões de interesse. Duplique a região de interesse selecionando Imagem, seguida de Duplicar e selecione apenas o canal correspondente ao canal colorido.Novamente, use a ferramenta Retângulo para desenhar uma região de interesse sobre toda a nova imagem e recuperar um perfil de fluorescência selecionando Analisar, seguido por Perfil de plotagem. Abra a lista de valores e copie-os para o software de planilha. Repita as etapas desde o desenho da região de interesse até a recuperação de um perfil de fluorescência para cada seção do intestino delgado, conforme descrito anteriormente em uma linha de régua diferente.No software de planilha, multiplique cada valor médio de intensidade pela largura constante do retângulo da região de interesse criada na etapa anterior. Isso produzirá o valor real da intensidade ao longo do intestino delgado em cada ponto. Aqui são mostrados os traços médios de fluorescência ao longo do comprimento do intestino delgado.A distribuição do material fluorescente varia de acordo com as propriedades materiais dos conteúdos intraluminais. Aumentar o número de compartimentos usados para classificar os mesmos conjuntos de dados brutos revela recursos de rastreamento granulares insolúveis com menos compartimentos. Caixas menores diminuem a incerteza da medição, aumentam a resolução espacial e refletem melhor o componente distributivo da motilidade do intestino delgado.O centro geométrico não consegue caracterizar completamente a distribuição espacial dos conteúdos intraluminais. Essa limitação da medida do centro geométrico é evidente na comparação entre líquidos e contas maiores. O traço fluorescente das contas maiores é mais distribuído, mas a média é de um ponto semelhante ao do líquido, independentemente da granularidade de binning, o que destaca a limitação de se concentrar apenas no centro geométrico.Para dar conta da natureza distributiva das contrações do intestino delgado, uma análise espectral de potência foi incorporada no presente estudo. Plotar o espectro de potência demonstra que, à medida que os tamanhos dos compartimentos diminuem, podemos observar frequências significativamente dominantes no espectro de contas maiores, mas não no espectro de contas pequenas. Algumas, mas não todas, dessas frequências dominantes adicionais estão presentes no espectro líquido.Os passos mais delicados deste protocolo são a gavagem e a dissecação. Estes devem ser padronizados pelos experimentadores antes de realizar esta técnica para fins experimentais. Este é um experimento terminal, pois o animal precisa ser sacrificado.Quando possível, maximize o uso de seu modelo animal realizando outros experimentos não terminais antes deste. Nosso grupo usou recentemente essa técnica para apoiar nossa descoberta de conjuntos de toque intestinal em que o intestino usa mecanorreceptores epiteliais para detectar propriedades físicas mais finas, assim como nossos dedos.

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