Name: studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00
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Agradecemos a la Sra. Lyndsay Busby por la asistencia administrativa y al Sr. Joel Pino por el apoyo de los medios de comunicación. Las subvenciones de los NIH apoyaron este trabajo: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 y Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de Mayo Clinic.
1. Configuración
<ol><li>Ratones rápidos de 8 a 10 semanas de edad durante 4 h. Proporcionar a los ratones acceso al agua. NOTA: Utilizamos ratones machos C57BL / 6J de tipo salvaje para todos los experimentos presentados aquí, pero se pueden realizar en ratones de cualquier cepa, género y genotipo.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Stevens, C. E., Hume, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , (2004).</li><li>Bayliss, W. M., Starling, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movements+and+innervation+of+the+small+intestine.">The movements and innervation of the small intestine.</a> The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).</li><li>Husebye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patterns+of+small+bowel+motility:+physiology+and+implications+in+organic+disease+and+functional+disorders.">The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders.</a> Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).</li><li>Bush, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+alosetron+on+spontaneous+migrating+motor+complexes+in+murine+small+and+large+bowel+in+vitro.">Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).</li><li>Der-Silaphet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+cells+of+cajal+direct+normal+propulsive+contractile+activity+in+the+mouse+small+intestine.">Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine.</a> Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).</li><li>Szurszewski, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+migrating+electric+complex+of+the+canine+small+intestine.">A migrating electric complex of the canine small intestine.</a> American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).</li><li>Deloose, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migrating+motor+complex:+control+mechanisms+and+its+role+in+health+and+disease.">The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).</li><li>Johansoon, C., Ekelund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+body+weight+and+the+gastric+and+intestinal+handling+of+an+oral+caloric+load.">Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load.</a> Gut. 17, 456-462 (1976).</li><li>Sarna, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+human+jejunal+contractions.">Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions.</a> American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).</li><li>Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+ofcanine+postprandial+upper+gastrointestinal+motility.">Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility.</a> American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).</li><li>Mayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+feelings:+the+emerging+biology+of+gut-brain+communication.">Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).</li><li>Alcaino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+gut+epithelial+enterochromaffin+cells+is+mechanosensitive+and+requires+Piezo2+to+convert+force+into+serotonin+release.">A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).</li><li>Kugler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+activates+neurites+and+somata+of+myenteric+neurons.">Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).</li><li>Mazzuoli, G., Schemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+enteric+neurons+in+the+myenteric+plexus+of+the+mouse+intestine.">Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine.</a> PloS One. 7 (7), 39887 (2012).</li><li>Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+cells+of+Cajal+mediate+mechanosensitive+responses+in+the+stomach.">Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).</li><li>Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+myenteric+sensory+neurons+in+the+mouse+small+intestine.">Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).</li><li>McIntyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bran,+ispaghula,+and+inert+plastic+particles+on+gastric+emptying+and+small+bowel+transit+in+humans:+the+role+of+physical+factors.">Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors.</a> Gut. 40 (2), 223-227 (1997).</li><li>Treichel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+mechanosensory+epithelial+cells+in+mouse+gut+intrinsic+tactile+sensitivity.">Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity.</a> Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).</li><li>Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+movement+with+evaluating+colonic+transit+in+humans.">More movement with evaluating colonic transit in humans.</a> Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).</li><li>Camilleri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastric+emptying+and+colonic+filling+of+solids+characterized+by+a+new+method.">Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method.</a> American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-illumination+intestine+projection+imaging+of+intestinal+motility+in+mice.">Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).</li><li>Woting, A., Blaut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+intestinal+permeability+and+gut-transit+time+determined+with+low+and+high+molecular+weight+fluorescein+isothiocyanate-dextrans+in+C3H+mice.">Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice.</a> Nutrients. 10 (6), 685 (2018).</li><li>Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurement+of+intestinal+transit+in+the+rat.">Accurate measurement of intestinal transit in the rat.</a> The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).</li><li>Moore, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+carbon+monoxide+suppresses+the+development+of+postoperative+ileus+in+the+murine+small+intestine.">Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine.</a> Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Baeyens, N., Schwartz, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mechanotransduction+on+vascular+smooth+muscle+myocytes'+cytoskeleton+and+contractile+function.">The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).</li><li>Mercado-Perez, A., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+feelings:+mechanosensing+in+the+gastrointestinal+tract.">Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. , 1-14 (2022).</li><li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li><li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+abdominal+autofluorescence+detected+by+in+vivo+fluorescence+imaging+of+living+mice.">Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice.</a> Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).</li><li>Szarka, L. A., Camilleri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+assessment+of+small-bowel+and+colonic+transit.">Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).</li><li>Padmanabhan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+transit+measurements+in+mice+with+99mTc-DTPA-labeled+activated+charcoal+using+NanoSPECT-CT.">Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).</li><li>Jang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+discrimination+in+rat+and+mouse+gastric+emptying.">Size discrimination in rat and mouse gastric emptying.</a> Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).</li><li>Zhu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+sensory+neurons+communicate+with+interstitial+cells+of+Cajal+to+affect+pacemaker+activity+in+the+small+intestine.">Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).</li><li>Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+touchy+business+of+gastrointestinal+(GI)+mechanosensitivity.">The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity.</a> Brain Research. 1693, 197-200 (2018).</li></ol>

El tracto gastrointestinal, al igual que otros órganos tubulares, como los vasos sanguíneos, requiere sensores mecánicos y efectores para mantener la homeostasis26,27,28. Sin embargo, el tracto gastrointestinal es único en el sentido de que las propiedades físicas de los materiales que lo atraviesan no son constantes a lo largo de las comidas. Los contenidos intraluminales de diversas propiedades físicas (sólido, líquido...

El tracto gastrointestinal (GI) humano es un sistema de órganos de varios pies de largo, aproximadamente aproximado como un tubo de diferentes dimensiones y propiedades físicas1. A medida que el contenido se mueve a través de su longitud, la función principal del tracto gastrointestinal es absorber sustancias críticas para la vida. El intestino delgado es específicamente responsable de la absorción de nutrientes. El tránsito del intestino delgado está estrechamente regulado para que coincida con las funciones de digestión y absorción, lo que resulta en varios patrones de motilidad. Bayliss y Starling describieron la "ley del intestino"2 en 1899, mostrando el programa de propulsión contráctil en el intestino conocido hoy como el reflejo peristáltico; El segmento proximal al bolo alimentario se contrae para impulsarlo hacia adelante, y el segmento distal se relaja para recibirlo. En teoría, este patrón por sí solo podría ser suficiente para transportar material por vía oral, pero más de un siglo de investigación ha pintado una imagen más compleja de la actividad contráctil en el tracto gastrointestinal. En humanos se reconocen tres períodos de motilidad del intestino delgado: el complejo motor migratorio (MMC), el período de ayuno y el período postprandial3. Los mismos patrones han sido reportados en ratones 4,5. El MMC es un patrón motor cíclico conservado en la mayoría de los mamíferos 6,7. La MMC tiene un patrón característico de cuatro fases que sirve como un marcador clínico útil en los trastornos gastrointestinales funcionales7. Las cuatro fases, en orden de ocurrencia, son (I) inactividad, (II) contracciones irregulares de baja amplitud, (III) contracciones regulares de alta amplitud y (IV) período de reducción de la actividad decreciente7. La MMC marca el patrón motor principal del período de ayuno3. Las MMC del período de ayuno aclaran el contenido del intestino delgado en preparación para la próxima comida.
Los patrones motores del período postprandial están optimizados para las funciones digestivas y absorbentes3. Independientemente de la composición calórica, el tránsito inicial es rápido a lo largo del intestino delgado, el contenido se extiende a lo largo del intestino y el tránsito posteriormente se ralentiza8. La absorción se optimiza aumentando el área de superficie de contacto y ralentizándola para aumentar el tiempo de residencia. Una vez que los nutrientes están dentro de la luz, el patrón dominante consiste en contracciones cercanas (separadas por <2 cm) descoordinadas (contracciones de segmentación), con algunas contracciones superpuestas de gran amplitud que abarcan toda la longitud del intestino delgado (contracciones peristálticas)9. Las contracciones de segmentación mezclan el contenido intraluminal en su lugar. Las grandes contracciones peristálticas ocasionales impulsan el contenido hacia el colon.
El momento de esta transición de regreso a las MMC depende del volumen de alimentos y la composición calórica10. Por lo tanto, el intestino delgado toma muestras de señales luminales para regular cuándo hacer la transición entre los períodos de motilidad. Las señales mecánicas, como las propiedades físicas del contenido luminal11, el volumen luminal y la tensión de la pared, activan las células mecanorreceptoras en la pared GI 12,13,14,15,16. De hecho, el aumento del componente sólido de una comida conduce a un aumento en el tránsito del intestino delgado17. Especulamos que las propiedades físicas, como el estado líquido o sólido del contenido intraluminal, deben involucrar diferentes mecanorreceptores debido a las diversas fuerzas que generan en la pared GI18.
El estándar de oro para medir el tránsito GI in vivo en humanos, como en ratones, es el uso de trazadores radiactivos medidos por gammagrafía cuando salen del estómago o transitan a lo largo del colon19,20. En los mamíferos, las bucles del intestino delgado de manera impredecible, lo que dificulta la obtención de imágenes in vivo de manera confiable, pero se están logrando avances21. Además, actualmente hay una falta de herramientas para cuantificar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes propiedades y tamaños. El punto de partida aquí fue una técnica estándar de oro que estandariza el estudio del tránsito del intestino delgado 22,23,24 y la función de barrera 22. Consiste en gavagar ratones con un material fluorescente, esperando que la motilidad GI transporte el material, extirpando el tracto gastrointestinal, segmentándolo en varias secciones desde el estómago hasta el colon, seccionando y homogeneizando los contenidos intraluminales para la cuantificación de fluorescencia. Hicimos dos mejoras. Primero, alteramos la composición del contenido gavagado para incluir perlas microscópicas fluorescentes para determinar cómo el intestino delgado distribuye las partículas físicas. En segundo lugar, mejoramos la resolución espacial al obtener imágenes de todo el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el colon ex vivo y utilizamos binning de tamaño variable para estandarizar nuestro análisis en animales. Postulamos que esto revela nuevos conocimientos sobre el equilibrio de las contracciones propulsivas versus segmentadas durante la fase postprandial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>other mice can be used with this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for spreadsheet analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g</td>
			<td>&#34;smaller beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g</td>
			<td>Cospheric</td>
			<td>UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g</td>
			<td>&#34;larger beads&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gavage needles</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-18-50-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to extract fluorescence profile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminated ruler paper (prepared in-house)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>n/a</td>
			<td>used for image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>r8881-100mg</td>
			<td>&#34;liquid&#34; condition in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying murine small bowel mechanosensing of luminal particulates

La motilidad gastrointestinal (GI) es crítica para la digestión y absorción normales. En el intestino delgado, que absorbe los nutrientes, la motilidad optimiza la digestión y la absorción. Por esta razón, algunos de los patrones de motilidad en el intestino delgado incluyen segmentación para la mezcla de contenidos luminales y peristaltismo para su propulsión. Las propiedades físicas de los contenidos luminales modulan los patrones de motilidad del intestino delgado. La estimulación mecánica de los circuitos mecanosensoriales gastrointestinales mediante el tránsito de contenidos luminales y la motilidad intestinal subyacente inicia y modula patrones motores gastrointestinales complejos. Sin embargo, los mecanismos mecanosensoriales que impulsan este proceso siguen siendo poco conocidos. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas para diseccionar cómo el intestino delgado maneja materiales de diferentes propiedades físicas. Para estudiar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes tamaños, hemos modificado un método in vivo establecido para determinar el tránsito del intestino delgado. Hacemos ratones vivos con líquido fluorescente o pequeñas perlas fluorescentes. Después de 30 minutos, diseccionamos los intestinos para obtener imágenes de la distribución de contenidos fluorescentes en todo el tracto gastrointestinal. Además de las mediciones de alta resolución del centro geométrico, utilizamos binning de tamaño variable y análisis espectral para determinar cómo los diferentes materiales afectan el tránsito del intestino delgado. Hemos explorado cómo un mecanismo de "toque intestinal" recientemente descubierto afecta la motilidad del intestino delgado utilizando este enfoque.

Mostramos resultados representativos desde el Paso 3 en adelante. La Figura 1 muestra los intestinos explantados intactos, con mediciones fluorescentes superpuestas. El estómago (púrpura) se coloca a lo largo del mismo eje que el intestino delgado (naranja), pero preferimos mover el ciego (azul) hacia un lado para evitar la superposición con el intestino grueso (naranja). Como se evidencia en el panel izquierdo, esto no siempre es posible debido al tamaño del órgano. Cortamos el intesti...

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Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

Para estudiar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes tamaños, hemos modificado un método in vivo establecido para determinar el tránsito del intestino delgado.

Estudio de la mecanodetección murina del intestino delgado de partículas luminales

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Este es un protocolo que estudia cómo el intestino delgado maneja materiales de diferentes propiedades físicas y cómo distribuye esos materiales en el espacio. Es una herramienta complementaria en nuestro estudio de la mecanosensibilidad intestinal. Las principales ventajas de este protocolo son que se puede utilizar para estudiar materiales o mezclas con diferentes propiedades físicas y que la resolución nos permite resolver tránsitos regionales sobre segmentos intestinales cortos.Esta técnica se suma a nuestra comprensión de la mecanosensibilidad intestinal. Nos ayuda a entender cómo el intestino delgado toma decisiones de tránsito basadas en las señales mecánicas que recibe del contenido intraluminal. Para comenzar, prepare el sonda nasogástrica conectando un tubo de alimentación de calibre 18 de espesor y 50 milímetros de longitud a una jeringa de 1 mililitro y extrayendo 200 microlitros de solución RITC o solución de microesfera.Luego, sujete manualmente al animal en ayunas usando la técnica de restricción con una sola mano, luego inserte suavemente el tubo de alimentación a través de la boca y el esófago del ratón hasta que ingrese al estómago. Una vez insertado, expulse lentamente el contenido de la jeringa hacia el estómago y retire con cuidado el tubo del ratón. Siguiendo el gavage, devuelve el ratón a la jaula.Antes de comenzar las disecciones, encienda el instrumento de imágenes in vivo para que alcance la temperatura deseada. Después de la eutanasia, coloque el ratón en posición supina en una etapa de disección y fije sus cuatro apéndices en la etapa para acceder al abdomen. A continuación, humedezca la superficie del abdomen con etanol al 70%.Luego, use pinzas de microdisección para tirar de la piel y hacer una incisión transversal con tijeras quirúrgicas afiladas de 1 centímetro por encima del ano. Para exponer la cavidad intraperitoneal, continúe la incisión verticalmente hacia arriba del abdomen hasta la caja torácica. Maneje suavemente los intestinos y aprecie su orientación en la cavidad abdominal antes de manipularlos.Corte el proximal a la unión gastroesofágica, separando así el estómago del esófago y desenrede suavemente el colon, el ciego y el intestino delgado tirando lentamente en la dirección opuesta. Use tijeras de microdisección para separar los accesorios del mesenterio a los intestinos. Más tarde, usando los fórceps, transfiera los intestinos disecados a la hoja de medición.Coloque el estómago a 0 milímetros y coloque los intestinos a lo largo de la regla hasta 200 milímetros, luego corte el intestino a 200 milímetros con tijeras de microdisección y repita este procedimiento de alineación intestinal. Una vez que el tejido esté dispuesto en la regla, coloque el ciego en paralelo con el tejido, pero no en contacto directo con él. Coloque la hoja de medición con el tejido diseccionado en un área oscura para que la fluorescencia se pueda preservar hasta que sea hora de obtener imágenes.Para iniciar la creación de imágenes ex vivo, abra el software de imágenes. Inicie sesión e inicialice el instrumento de imágenes para que esté listo para la adquisición de imágenes. Para el gavage RITC, establezca Excitación en 535 nanómetros y Emisiones, 600 nanómetros.Mientras que para las perlas de microesferas verdes, establezca Excitación en 465 nanómetros y Emisión en 520 nanómetros. Ahora, establezca la exposición en Auto y seleccione el campo de visión. Después de asegurarse de que los intestinos no se han desplazado durante el transporte, coloque la hoja de medición en el instrumento dentro del campo de visión.Cierre de forma segura la puerta del instrumento y seleccione Instantánea para fotografiar el campo de visión. Guarde las imágenes recopiladas en una unidad flash para su análisis. A continuación, guarde las capturas individuales de las imágenes fluorescentes y fotográficas.Una superposición de la fotografía y la fluorescencia indica la ubicación de los materiales fluorescentes en el tracto gastrointestinal. Abra los archivos de imagen fluorescente y fotográfica en el software de edición de imágenes para su análisis. Ajuste el tamaño de píxel de ambas imágenes para tener las dimensiones exactas y cierre el archivo de fotografía.Para la imagen fluorescente, utilice una herramienta de borrador para eliminar el fondo y hacerlo transparente. Cree una nueva capa. Elija un relleno negro en la capa y arrastre la capa para que quede debajo de la capa con la imagen fluorescente y haga un fondo completamente negro.Guarde la nueva imagen fluorescente que contiene solo la señal fluorescente sobre un fondo negro como un nuevo archivo TIF. Abra las nuevas imágenes fluorescentes y fotográficas en ImageJ. Convierta cada imagen en una imagen de 30 bits eligiendo Imagen, seguido de Tipo y 30 bits.Cree una imagen combinada de ambos eligiendo Imagen, seguido de Color y Combinar canales. En el cuadro de diálogo que se abre, seleccione el archivo de fotografía para el canal gris y el archivo fluorescente debajo de cualquier canal de color. Desactive la escala de la imagen combinada seleccionando Analizar, seguido de Definir escala y Haga clic para quitar escala.Seleccione la herramienta Rectángulo en ImageJ. Dibuje un rectángulo alrededor de una sección del intestino delgado prestando mucha atención al ancho de esta región de interés, ya que debe permanecer constante entre todas las regiones de interés. Duplique la región de interés seleccionando Imagen, seguido de Duplicar y seleccione solo el canal correspondiente al canal coloreado.De nuevo, utilice la herramienta Rectángulo para dibujar una región de interés sobre toda la nueva imagen y recuperar un perfil de fluorescencia seleccionando Analizar, seguido de Trazar perfil. Abra la lista de valores y cópielos en un software de hoja de cálculo. Repita los pasos desde el dibujo de la región de interés hasta la recuperación de un perfil de fluorescencia para cada sección del intestino delgado como se describió anteriormente en una fila de regla diferente.En el software de hoja de cálculo, multiplique cada valor de intensidad promedio por el ancho constante del rectángulo de región de interés creado en el paso anterior. Esto producirá el valor de intensidad real a lo largo del intestino delgado en cada punto. Aquí se muestran los rastros de fluorescencia promedio a lo largo del intestino delgado.La distribución del material fluorescente varía según las propiedades del material del contenido intraluminal. El aumento del número de contenedores utilizados para ordenar los mismos conjuntos de datos sin procesar revela características de rastreo granular irresolubles con menos contenedores. Los contenedores más pequeños disminuyen la incertidumbre de medición, aumentan la resolución espacial y reflejan mejor el componente distributivo de la motilidad del intestino delgado.El centro geométrico no caracteriza completamente la distribución espacial de los contenidos intraluminales. Esta limitación de la medición del centro geométrico es evidente en la comparación entre líquidos y perlas más grandes. El rastro fluorescente de las cuentas más grandes está más distribuido, pero promedia hasta un punto similar al del líquido, independientemente de la granularidad de agrupación, lo que resalta la limitación de centrarse únicamente en el centro geométrico.Para tener en cuenta la naturaleza distributiva de las contracciones del intestino delgado, se incorporó un análisis espectral de potencia en el presente estudio. Trazar el espectro de potencia demuestra que a medida que los tamaños de los contenedores se reducen, podemos observar frecuencias significativamente dominantes en el espectro de cuentas más grandes, pero no en el de las cuentas pequeñas. Algunas, pero no todas, de esas frecuencias dominantes adicionales están presentes en el espectro líquido.Los pasos más delicados de este protocolo son el sonda y la disección. Estos deben ser estandarizados por los experimentadores antes de realizar esta técnica con fines experimentales. Este es un experimento terminal, ya que el animal necesita ser sacrificado.Cuando sea posible, maximice el uso de su modelo animal realizando otros experimentos no terminales antes de este. Nuestro grupo ha utilizado recientemente esta técnica para apoyar nuestro hallazgo de conjuntos de contacto intestinal donde el intestino utiliza mecanorreceptores epiteliales para detectar propiedades físicas más finas, al igual que lo hacen nuestros dedos.

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