Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

يتم تمويل B.A-C من قبل وزارة العلوم والابتكار الإسبانية (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I) ، من قبل مجتمع مدريد المتمتع بالحكم الذاتي (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) ، ومنح MICINN (PID2020-113270RA-I00). يتم تمويل R. A-P من قبل مجتمع مدريد المستقل (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057). يتم تمويل E.M.S. من قبل جمعية ماكس بلانك ، وهي جائزة الباحث المتقدم من مجلس البحوث الأوروبي (منحة 743216) ، DFG CRC 1080: الآليات الجزيئية والخلوية للتوازن العصبي ، و DFG CRC 902: المبادئ الجزيئية للتنظيم القائم على الحمض النووي الريبي. نشكر DC Dieterich و P. Landgraf على نصائحهم الفنية وتوليف DST-Alkyne. نشكر E. Northrup و S. Zeissler و S. Gil Mast ومرفق الحيوانات في MPI لأبحاث الدماغ على دعمهم الممتاز. نشكر ساندرا جوبلز على مشاركة خط الماوس Nex-Cre. نشكر أنطونيو جي كاروجيو على مساعدته في تحرير اللغة الإنجليزية. بكالوريوس - ج. تصميم التجارب وإجرائها وتحليلها. B.N-A ، D.O.C ، R.A-P ، C. E. ، و S. T. د. إجراء التجارب وتحليلها. B.A-C و E.M.S. صممت التجارب ، وأشرفت على المشروع ، كتب B.A-C الورقة. قام جميع المؤلفين بتحرير الورقة.

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بإذن من مكاتب الحكومة المحلية في ألمانيا (RP Darmstadt ؛ البروتوكولات: V54-19c20 / 15-F122 / 14 ، V54-19c20 / 15-F126 / 1012) أو إسبانيا (لجنة التجارب على الحيوانات في UCM والاستشارات البيئية في Comunidad de Madrid ، رقم البروتوكول: PROEX 005.0 / 21) ومتوافقة مع قواعد جمعية ماكس بلانك واللوائح الإسبا...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

الجوانب الحاسمة للبروتوكول هي ؛ إدراج الضوابط السلبية ، وجود ما يكفي من التكرارات البيولوجية ، ومسار إدارة ANL ، والكمية ، والمدة ، وألكلة العينات ، وتركيز الألكين ، والقضاء على β-mercaptoethanol عند استخدام DST-alkyne.
من المهم تضمين عينات التحكم السلبية الناتجة عن الحيوانات التي تحمل ?...

يحدث توازن البروتين الشاذ بسبب اختلال التوازن في تخليق البروتين وتدهوره. ترتبط العديد من الأمراض بالتغيرات في توازن البروتين. السمة المميزة لبعض الأمراض هي وجود مجاميع في مواقع تحت خلوية مختلفة ومناطق الدماغ. الاتزان الداخلي للبروتين ليس مهما في المرض فحسب ، بل يلعب أيضا دورا مهما في الوظيفة الطبيعية للعضو والخلية1. على سبيل المثال ، تخليق البروتين ضروري للعديد من أشكال اللدونة العصبية 2,3 ، على النحو الذي يحدده استخدام مثبطات كيميائية تمنع تخليق البروتين4. ومع ذلك ، ليس من الواضح في أي أنواع الخلايا يتم تغيير البروتين لدعم التعلم والذاكرة ، ولا يفهم أي بروتينات معينة في كل نوع من أنواع الخلايا تزيد أو تنقص في تخليقها أو تدهورها. وبالتالي ، فإن الدراسة الشاملة لتوازن البروتين تتطلب القدرة على التمييز بين البروتينات القادمة من أنواع معينة من الخلايا. في الواقع ، كان تحديد البروتينات الخاصة بنوع الخلية لدراسة العمليات الخلوية التي تحدث في بيئة متعددة الخلايا عقبة مهمة في البروتيوميات. لهذا السبب ، قمنا بتطوير تقنية باستخدام تعبير MetRS * جنبا إلى جنب مع طرق التعامد الحيوي التي أثبتت أنها طريقة فعالة لتحديد وتنقية البروتينات المحددة من نوع الخلية ، وسد هذه الفجوة5،6،7.
يسمح التعبير عن MetRS * الطافر (MetRS L274G) بتحميل ANL التناظري للميثيونين غير الكنسي في tRNA 8,9 المقابل ودمجه لاحقا في البروتينات. عندما يتم تنظيم تعبير MetRS * بواسطة محفز خاص بنوع الخلية ، سيتم دمج الحمض الأميني غير المتعارف عليه في البروتينات بطريقة انتقائية للخلايا. بمجرد دمج ANL في البروتينات ، يمكن تشغيله بشكل انتقائي عن طريق كيمياء النقر وبعد ذلك إما عن طريق التصوير (FUNCAT) أو عن طريق Western Immunoblot (BONCAT). بدلا من ذلك ، يمكن تنقية البروتينات بشكل انتقائي وتحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي (MS). باستخدام هذه التقنية ، أنشأنا خط ماوس يعبر عن بروتين MetRS * تحت سيطرة Cre recombinase. بالنظر إلى العدد المتزايد من خطوط Cre-mouse المتاحة ، يمكن استخدام نظام MetRS * في أي مجال لدراسة أي نوع من الخلايا من أي نسيج يوجد له خط Cre-line موجود. يمكن وضع العلامات على البروتين باستخدام ANL في المختبر أو في الجسم الحي ، ولا يغير سلوك الماوس أو سلامة البروتين6. يمكن تكييف الفترة الزمنية لوضع العلامات مع السؤال العلمي لكل باحث ، ووضع العلامات على البروتينات المركبة حديثا (أوقات وضع العلامات الأقصر) أو البروتينات بأكملها (أوقات وضع العلامات الأطول). يقتصر استخدام هذه التقنية على عدد الخلايا من النوع الذي يرغب الباحث في دراسته ؛ ومن ثم فإن عزل البروتين عن أنواع الخلايا ذات الأعداد المنخفضة أو معدلات الأيض المنخفضة غير ممكن بهذه الطريقة. الهدف من الطريقة المقدمة هو تحديد البروتينات / البروتينات الخاصة بنوع الخلية المصنفة في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، نصف كيفية تسمية البروتينات الخاصة بنوع الخلية باستخدام ANL في الفئران الحية وتنقية البروتينات المصنفة. بعد التنقية ، يمكن تحديد البروتينات من خلال بروتوكولات قياس الطيف الكتلي الروتينية 5,10. يسمح الحد من تعقيد العينة الذي تم تحقيقه في هذه الطريقة عن طريق التنقية الانتقائية للبروتينات من مجموعات خلوية محددة للمجرب باكتشاف التغيرات الطفيفة في البروتينات ، على سبيل المثال ، استجابة للتغيرات البيئية. يمكن تحقيق تنقية البروتينات الموسومة في ~ 10 أيام ، ولا تشمل تحليل MS أو فترة وضع العلامات. هنا ، نصف طريقتين لإدارة ANL للفئران المعبرة عن MetRS * ، وهما (1) إضافة الأحماض الأمينية في مياه الشرب ، و (2) إدخال ANL عن طريق الحقن داخل الصفاق. بغض النظر عن الطريقة المختارة لإدارة ANL ، فإن خطوات العزل والتنقية هي نفسها (من الخطوة 2 فصاعدا).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

يعد فهم الاتزان الداخلي للبروتين في الجسم الحي أمرا أساسيا لمعرفة كيفية عمل الخلايا في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. يصف البروتوكول الحالي وضع العلامات في الجسم الحي والتنقية اللاحقة للبروتينات المركبة حديثا باستخدام خط فأر مهندس لتوجيه وضع العلامات على البروتين إلى مجموعات خلوية محددة. وهو خط قابل للتحريض عن طريق تعبير Cre recombinase ل L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS *) ، مما يتيح دمج أزيدونونورليوسين (ANL) في البروتينات ، والتي لن تحدث بخلاف ذلك. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، من الممكن تنقية البروتينات الخاصة بنوع الخلية المصنفة في الجسم الحي واكتشاف التغيرات الطفيفة في محتوى البروتين بسبب تقليل تعقيد العينة.

باتباع البروتوكول الموصوف (الملخص في الشكل 1) ، تم إعطاء ANL للفئران إما عن طريق الحقن داخل الصفاق يوميا (400 mM ANL 10 مل / كجم ، Nex-Cre :: MetRS *) لمدة 7 أيام ، أو عن طريق مياه الشرب (0.7٪ مالتوز ، 1٪ ANL ، CamkII-Cre::MetRS *) لمدة 21 يوما. بعد وضع العلامات ، تم تشريح مناطق الدماغ المقابلة ، ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء وضع العلامات على البروتين الخاص بنوع الخلية باستخدام أزيدونونورليوسين (ANL) باستخدام خط ماوس يعبر عن سينثيتاز L274G-Methionine tRNA المتحور (MetRS *) والخطوات اللازمة لعزل البروتينات الخاصة بنوع الخلية الموصوفة. نحدد طريقين محتملين لإدارة ANL في الفئران الحية عن طريق (1) مياه الشرب و (2) الحقن داخل الصفاق.

تنقية البروتين المحدد من نوع الخلية والتعرف عليه من الأنسجة المعقدة باستخدام خط ماوس الميثيونين tRNA Synthetase الطافر

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

يتيح هذا البروتوكول تسمية البروتينات بطريقة محددة لنوع الخلية. هذه هي التقنية الأولى التي توفر مثل هذا الاحتمال ويمكن القيام به في المختبر أو في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البروتينات المحددة لنوع الخلية المسمى يمكن تنقيتها دون تحديد هويتها ، أو تصورها في الموقع بواسطة الفلورسنت المناعي.للبدء في تحضير محللة الأنسجة عن طريق إضافة محلول تحلل بحجم 12 إلى 15 ضعف الوزن الرطب للأنسجة وسحن الأنسجة حتى يتم تجانسها. سخني هذا التجانس لمدة 15 دقيقة إلى 75 درجة مئوية لتفكيك البروتين ثم قم بطرد العينة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. يمكن تخزين هذه العينة عند 80 درجة سلزية تحت الصفر.بعد ذلك ، بالنسبة للألكلة ، قم بتخفيف العينة المتجانسة مرتين إلى ثلاث مرات في محلول ملحي للفوسفات يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من EDTA. ثم أضف اليودواسيتاميد الطازج إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمول. اترك العينة لمدة ساعة إلى ساعتين عند 20 درجة مئوية في الظلام.كرر خطوات إضافة وحضانة اليودواسيتاميد مرتين. قم بإعداد العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة عن طريق تحريك الأعمدة أولا. ثم إزالة الغطاء وقطع الجزء السفلي والطرد المركزي لهم.بعد ذلك ، قم بإجراء تبادل المخزن المؤقت عن طريق موازنة أعمدة تبادل المخزن المؤقت أولا باستخدام المخزن المؤقت لتبادل كيمياء النقر ثم تبادل جميع عينات الألكلة. لتقييم دمج azidonorleucine ، خذ 40 ميكرولترا من العينة المشار إليها وأضف محلول ملحي فوسفات إلى الحجم النهائي البالغ 120 ميكرولتر. ثم قم بإعداد تفاعل كيمياء النقر عن طريق تحريك التفاعل لمدة 20 ثانية.بعد إضافة كل كاشف بالترتيب المشار إليه في أسرع وقت ممكن ، احتضان العينات في الظلام عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع الدوران المستمر. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق عند 17،000 مرة G بعد الطرد المركزي ، ستظهر حبيبات فيروزية قليلا. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتخزين العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.لتنقية البروتين المسمى. إخضاع جميع العينات لإجراء تبادل مؤقت كما هو موضح لتنظيف بقايا الألكاين الحرة باستخدام مخزن ربط النيوترافيدين كمخزن مؤقت للتوازن. ثم اغسل حبات النيوترافيدين عالية السعة ثلاث مرات عن طريق خلط الخرز مع المخزن المؤقت للربط.الطرد المركزي الخليط ، وتجاهل الطافي وكرر هذا ثلاث مرات. ثم قم بإعداد ملاط واحد إلى واحد عن طريق إضافة نفس الحجم من حبات النيوترافيدين الجافة وعازلة ربط النيوترافيدين. ضع جانبا 20 إلى 40 ميكرولتر من كل عينة كمحلول منقى مسبقا وقم بتخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.بعد قياس تركيز البروتين في العينة ، امزج مليغرام واحد من البروتين مع 40 ميكرولتر من ملاط الخرز. احتضان الخليط طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع الدوران المستمر لتمكين البروتينات الموسومة من الارتباط بالخرزات. في اليوم التالي جمع الطافت عن طريق الطرد المركزي.ضع حصة 20 إلى 40 ميكرولتر من المادة الطافية جانبا لتحليلها لاحقا وقم بتجميد الباقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، اغسل الخرز ثلاث مرات عن طريق إضافة محلول غسيل نيوترافيدين مبرد. ترسيب الخرز والتخلص من المادة الطافية.ثم أضف نفس المخزن المؤقت واحتضن الخرز لمدة 10 دقائق تحت دوران مستمر عند أربع درجات مئوية قبل التخلص من المادة الطافية. كرر الغسيل باستخدام مخازن غسيل النيوترافيدين الثانية والثالثة ، وقم بتخفيف البروتينات التي تم النقر عليها عن طريق احتضان الخرز لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع حجم عازلة شطف النيوترافيدين ، المقابلة لحجم واحد من الخرز الجاف المستخدم. أثناء الشطف ، حافظ على الخرزات معلقة عند 1000 دورة في الدقيقة في شاكر كتلة حرارية مراوغة مرتين وادمج كلا العود.تم تحليل تفاعلات النقر بواسطة صفحة SDS واللطخة المناعية الغربية. يتم عرض صور تمثيلية للتجارب لإدارة أزيدونونورليوسين عن طريق الحقن داخل الصفاق ولإدارة أزيدونونورليوسين عن طريق مياه الشرب. تقدم تجربة أخرى مثالا لتحديد تركيز الألكاين القابل للانقسام لثاني كبريتيد البيوتين.في هذا المثال، يكون التغير في الطي بين العينة المسماة والمجموعة الضابطة أعلى عند تركيز ألكاين 14 ميكرومولار. يظهر هنا مثال على نتيجة قياس الطيف الكتلي مع إثراء واضح في العينة الموسومة بالأزيدونونورليوسين مقارنة بالمجموعة الضابطة. كان هذا الاختلاف مرئيا بالفعل في وصمة البروتين الكلية.إلى جانب التغيرات في شدة الببتيد ، توجد أيضا بروتينات فريدة في كلتا العينتين. هذا بروتوكول معقد تقنيا وهو خطوة يجب اتباعها بعناية باستخدام ألكلة الضوابط السلبية المناسبة ، والتنظيف المناسب (غير الواضح) والكافي للأرشيف بدون نقر. خطواتنا الرئيسية في هذا البروتوكول ، يمكن تحديد البروتينات النقية إما عن طريق قياس الطيف الكتلي إذا كان اهتمام الباحثين هو دراسة البروتينات أو تحميلها في هلام لدراسة البروتينات ذات الأهمية بواسطة اللطخة الغربية.إن قدرة هذه الطريقة على تسمية البروتينات من أصل خلوي معين لها الكثير من التطبيقات مثل توتر البروتينات أو دراسة تخليق البروتين في المختبر أو في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

تنقية Prominin-1+ الخلايا الجذعية من المخيخ الماوس بعد الولادة

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...