Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

B.A-C finansieres af det spanske ministerium for videnskab og innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), af den selvstyrende region Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) og MICINN (PID2020-113270RA-I00) tilskud. R. A-P er finansieret af den selvstyrende region Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. er finansieret af Max Planck Society, en Advanced Investigator-pris fra Det Europæiske Forskningsråd (bevilling 743216), DFG CRC 1080: Molekylære og cellulære mekanismer af neural homeostase og DFG CRC 902: Molekylære principper for RNA-baseret regulering. Vi takker D.C Dieterich og P. Landgraf for deres tekniske rådgivning og syntesen af DST-Alkyne. Vi takker E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast og MPI's dyrefacilitet for hjerneforskning for deres fremragende støtte. Vi takker Sandra Goebbels for at dele Nex-Cre muselinjen. Vi takker Antonio G. Carroggio for hans hjælp med engelsk redigering. B.A-C. designet, udført og analyseret eksperimenter. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. og S. t. D. udførte og analyserede eksperimenter. B.A-C og E.M.S. designede eksperimenter og overvågede projektet, skrev B.A-C papiret. Alle forfattere redigerede papiret.

Alle dyreforsøg blev udført med tilladelse fra de lokale regeringskontorer i Tyskland (RP Darmstadt; protokoller: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) eller Spanien (Udvalget for Dyreforsøg ved UCM og Miljørådgivning i Comunidad de Madrid, protokolnummer: PROEX 005.0/21) og er i overensstemmelse med Max Planck Society-reglerne og spanske regler og følger EU's retningslinjer for dyrevelfærd.
1. In vivo metabolisk mærkning med ANL
<ol><li>Drikkevand:<...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

De kritiske aspekter af protokollen er; inkludering af negative kontroller, der har tilstrækkelige biologiske replikater, ANL-administrationsvej, mængde og varighed, alkylering af prøverne, alkynkoncentration og eliminering af β-mercaptoethanol ved anvendelse af DST-alkyn.
Det er vigtigt at inkludere negative kontrolprøver, der stammer fra ANL-mærkede dyr uden Cre-driver og derfor ingen MetRS *-udtryk. Disse prøver skal underkastes hvert trin, der er beskrevet i protokollen, parallelt m...

Afvigende protein homeostase er forårsaget af en ubalance i proteinsyntese og nedbrydning. Flere sygdomme er relateret til ændringer i proteinhomeostase. Kendetegnende for nogle sygdomme er tilstedeværelsen af aggregater i forskellige subcellulære steder og hjerneområder. Protein homeostase er ikke kun vigtig i sygdom, men spiller også en afgørende rolle i normal organ og cellulær funktion1. For eksempel er proteinsyntese nødvendig for mange former for neuronal plasticitet2,3, som bestemt ved anvendelse af kemiske hæmmere, der blokerer proteinsyntese4. Det er imidlertid hverken klart, i hvilke celletyper proteomet ændres for at understøtte læring og hukommelse, og det forstås heller ikke, hvilke specifikke proteiner i hver celletype der øges eller falder i deres syntese eller nedbrydning. Således kræver en omfattende undersøgelse af proteinhomeostase evnen til at differentiere proteomer, der kommer fra specifikke celletyper. Faktisk har identifikationen af celletypespecifikke proteomer til undersøgelse af cellulære processer, der forekommer i et flercellet miljø, været en vigtig hindring i proteomics. Af denne grund udviklede vi en teknik ved hjælp af MetRS * -udtryk kombineret med bioortogonale metoder, der har vist sig at være en effektiv måde at identificere og rense celletypespecifikke proteomer og udfylde dette hul 5,6,7.
Ekspressionen af en mutant MetRS* (MetRS L274G) gør det muligt at indlæse den ikke-kanoniske methioninanalog ANL i det tilsvarende tRNA 8,9 og dets efterfølgende inkorporering i proteiner. Når MetRS*-ekspression reguleres af en celletypespecifik promotor, vil den ikke-kanoniske aminosyre blive inkorporeret i proteinerne på en celleselektiv måde. Når ANL er inkorporeret i proteinerne, kan det selektivt funktionaliseres ved klikkemi og efterfølgende enten visualiseres ved billeddannelse (FUNCAT) eller ved Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt oprenses og identificeres ved massespektrometri (MS). Ved hjælp af denne teknologi skabte vi en muselinje, der udtrykker MetRS*-proteinet under kontrol af Cre-rekombinasen. I betragtning af det stigende antal tilgængelige Cre-mus-linjer kan MetRS*-systemet bruges i ethvert felt til at studere enhver celletype fra ethvert væv, for hvilket der er en eksisterende Cre-line. Proteinmærkning med ANL er mulig in vitro eller in vivo og ændrer ikke musens adfærd eller proteinintegritet6. Mærkning af tidsperiode kan tilpasses det videnskabelige spørgsmål for hver forsker, mærkning af nyligt syntetiserede proteiner (kortere mærkningstider) eller hele proteomer (længere mærkningstider). Brugen af denne teknik er begrænset af antallet af celler af den type, som forskeren er villig til at studere; derfor er proteinisolering fra celletyper med lavt antal eller lave stofskifter ikke mulig ved denne metode. Målet med den præsenterede metode er at identificere celletypespecifikke proteiner/proteomer mærket in vivo. I denne protokol beskriver vi, hvordan man mærker celletypespecifikke proteomer med ANL i levende mus og renser de mærkede proteiner. Efter oprensning kan proteiner identificeres ved rutinemæssige massespektrometriprotokoller 5,10. Reduktionen af prøvekompleksitet opnået i denne metode ved selektiv oprensning af proteiner fra specifikke cellulære populationer gør det muligt for eksperimentatoren at detektere subtile ændringer i proteomer, for eksempel som reaktion på miljøændringer. Oprensning af de mærkede proteiner kan opnås på ~ 10 dage, ikke inklusive MS-analysen eller mærkningsperioden. Her beskriver vi to metoder til ANL-administration til MetRS*-ekspressive mus, nemlig (1) tilsætning af aminosyren i drikkevandet og (2) introduktion af ANL ved intraperitoneale injektioner. Uanset hvilken metode der er valgt til ANL-administration, er isolerings- og rensningstrinnene de samme (fra trin 2 og frem).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

At forstå proteinhomeostase in vivo er nøglen til at vide, hvordan cellerne fungerer under både fysiologiske og sygdomsforhold. Den nuværende protokol beskriver in vivo-mærkning og efterfølgende oprensning af nyligt syntetiserede proteiner ved hjælp af en konstrueret muselinje til direkte proteinmærkning til specifikke cellulære populationer. Det er en inducerbar linje ved Cre-rekombinaseekspression af L274G-methionin tRNA-syntetase (MetRS*), hvilket muliggør azidonorleucin (ANL) inkorporering i proteinerne, som ellers ikke vil forekomme. Ved hjælp af den metode, der er beskrevet her, er det muligt at rense celletypespecifikke proteomer mærket in vivo og detektere subtile ændringer i proteinindholdet på grund af reduktion af prøvekompleksitet.

Efter den beskrevne protokol (opsummeret i figur 1) blev ANL administreret til mus enten ved daglige intraperitoneale injektioner (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) i 7 dage eller via drikkevand (0,7 % Maltose, 1 % ANL, CamkII-Cre::MetRS*) i 21 dage. Efter mærkning blev de tilsvarende hjerneområder dissekeret, lyseret, alkyleret og klikket. Klikreaktioner blev analyseret af SDS-PAGE og Western Immunoblot. Repræsentative billeder af forsøgene er vist i figur...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører celletypespecifik proteinmærkning med azidonorleucin (ANL) ved hjælp af en muselinje, der udtrykker en mutant L274G-methionin tRNA-syntetase (MetRS *) og de nødvendige trin til mærkning af celletypespecifikke proteiner. Vi skitserer to mulige ANL-administrationsveje i levende mus ved (1) drikkevand og (2) intraperitoneale injektioner.

Celletypespecifik proteinrensning og identifikation fra komplekse væv ved hjælp af en mutant methionin tRNA-syntetasemuselinje

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Denne protokol gør det muligt at mærke proteiner på en celletypespecifik måde. Dette er den første teknik, der giver en sådan mulighed, og det kan gøres in vitro eller in vivo. Den største fordel ved teknikken er, at de mærkede celletypespecifikke proteiner kan renses uidentificeret eller visualiseres in situ ved immunfluorescerende.For at begynde at forberede vævslysatet ved at tilføje lysisbuffer ved et volumen på 12 til 15 gange vævets våde vægt og triturere vævet, indtil det er homogeniseret. Opvarm dette homogenat i 15 minutter til 75 grader Celsius for at denaturere proteinet, centrifugerer derefter prøven og overfører supernatanten til et nyt rør. Denne prøve kan opbevares ved minus 80 grader Celsius.Dernæst fortyndes den homogeniserede prøve to til tre gange i phosphatsaltbuffer indeholdende en EDTA-fri proteasehæmmer til alkylering. Derefter tilsættes frisklavet iodoacetamid til en endelig koncentration på 20 millimol. Lad prøven stå i en til to timer ved 20 grader Celsius i mørket.Gentag iodoacetamidtilsætnings- og inkubationstrinnene to gange. Forbered kolonnen i henhold til producentens anvisninger ved først at hvirvle kolonnerne. Fjern derefter låget, der skærer den nederste del og centrifugerer dem.Udfør derefter en bufferudveksling ved først at ligevægte bufferudvekslingskolonnerne ved hjælp af klikkemiudvekslingsbufferen og derefter udveksle alle alkylerede prøver. For at evaluere azidonorleucin-inkorporeringen tages 40 mikroliter af den omtalte prøve og tilsættes fosfatsaltbuffer til et endeligt volumen på 120 mikroliter. Indstil derefter klikkemireaktionen ved at hvirvle reaktionen i 20 sekunder.Efter tilsætning af hvert reagens i den angivne rækkefølge så hurtigt som muligt, inkuberes prøverne i mørke ved fire grader Celsius natten over med kontinuerlig rotation. Den følgende dag centrifugeres prøverne i fem minutter ved 17.000 gange G efter centrifugering vil en let turkis pellet være synlig. Overfør supernatanten til et nyt rør, og opbevar prøven ved minus 80 grader Celsius.Til mærket proteinrensning. Alle prøverne underkastes en bufferudvekslingsprocedure som påvist for at rense rester af fri alkyn ved hjælp af neutravidinbindingsbuffer som ligevægtsbuffer. Vask derefter neutravidinperlerne med høj kapacitet tre gange ved at blande perlerne med bindingsbufferen.Centrifuger blandingen, kassér supernatanten og gentag dette tre gange. Forbered derefter en en-til-en gylle ved at tilføje det samme volumen neutravidin tørre perler og neutravidinbindende buffer. Afsæt 20 til 40 mikroliter af hver prøve som forrenset lysat, og opbevar det ved minus 20 grader Celsius.Efter måling af proteinkoncentrationen i prøven blandes et milligram protein med 40 mikroliter af perlegyllen. Inkuber blandingen natten over ved fire grader Celsius med kontinuerlig rotation, der gør det muligt for de mærkede proteiner at binde sig til perlerne. Den følgende dag samles supernatanten ved centrifugering.Sæt en 20 til 40 mikroliter aliquot af supernatanten til side til senere analyse og frys resten ved minus 80 grader Celsius. Vask derefter perlerne tre gange ved at tilføje kølet neutravidin vaskebuffer en. Sedimentering af perlerne og kassering af supernatanten.Tilsæt derefter den samme buffer og inkuber perlerne i 10 minutter under kontinuerlig rotation ved fire grader Celsius, før supernatanten kasseres. Gentag vasken med neutravidinvaskebuffere to og tre, og eluer de klikkede proteiner ved at inkubere perlerne i 30 minutter ved 20 grader Celsius med et volumen neutravidin-elutionsbuffer, svarende til et volumen af de anvendte tørre perler. Under elueringen skal du holde perlerne i suspension ved 1000 omdrejninger i minuttet i en termoblokryster undvige to gange og kombinere begge eluter.Klikreaktioner blev analyseret af SDS-side og Western immuno blot. Repræsentative billeder af forsøgene er vist til administration af azidonorleucin ved intraperitoneal injektion og til administration af azidonorleucin via drikkevand. Et yderligere forsøg giver et eksempel til bestemmelse af den optimale koncentration af disulfidbiotin, der kan spaltes, alkynkoncentration.I dette eksempel er foldændringen mellem den mærkede prøve og kontrol højest ved 14 mikromolær alkynkoncentration. Et eksempel på et massespektrometriresultat med en klar berigelse i den azidonorleucinmærkede prøve sammenlignet med kontrollen er vist her. Denne forskel var allerede synlig i den samlede proteinplet.Udover ændringer i peptidintensitet findes der også unikke proteiner i begge prøver. Dette er en teknisk kompleks protokol, og det er et trin, der skal følges nøje ved hjælp af korrekt negativ kontrol alkylering, korrekt (utydelig) og tilstrækkelig rengøring af ikke-klikarkivet. Vores vigtigste trin i denne protokol, oprensede proteiner, kan enten identificeres ved massespektrometri, hvis forskernes interesse er at studere proteiner eller indlæse det i en gel til undersøgelse af proteiner af interesse ved western blot.Denne metodes evne til at mærke proteiner fra en bestemt cellulær oprindelse har mange anvendelser såsom spændingen af proteiner eller undersøgelsen af proteinsyntese in vitro eller in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolerende LacZ-udtrykkende celler fra mus indre øre Væv ved anvendelse af flowcytometri

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolering og kvantificering af botulinumneurotoksin Fra komplekse matricer Brug af BoTest Matrix Analyser

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Oprensning af musehjerne Fartøjer

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Ekstern ekspression af neuroner ved hjælp af elektriske og magnetiske felter i en- og todimensionelle kulturer

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kvantificere den heterogen fordeling af en Synaptic Protein i mus hjernen bruger immunfluorescens

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Rensning af Prominin-1+ Stamceller fra Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...