Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

B.A-C wordt gefinancierd door het Spaanse ministerie van Wetenschap en Innovatie (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), door de autonome gemeenschap Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) en MICINN (PID2020-113270RA-I00) subsidies. R. A-P wordt gefinancierd door de autonome gemeenschap Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. wordt gefinancierd door de Max Planck Society, een Advanced Investigator award van de European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis en DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Wij danken D.C. Dieterich en P. Landgraf voor hun technisch advies en de synthese van de DST-Alkyne. We bedanken E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast en de dierenfaciliteit van de MPI for Brain Research voor hun uitstekende ondersteuning. Wij danken Sandra Goebbels voor het delen van de Nex-Cre muislijn. Wij danken Antonio G. Carroggio voor zijn hulp bij de Engelse redactie. B.A-C. ontworpen, uitgevoerde en geanalyseerde experimenten. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., en S.t. D. voerde experimenten uit en analyseerde deze. B.A-C en E.M.S. ontwierpen experimenten en begeleidden het project, B.A-C schreef het artikel. Alle auteurs redigeerden het artikel.

Alle dierproeven werden uitgevoerd met toestemming van de lokale overheidskantoren in Duitsland (RP Darmstadt; protocollen: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) of Spanje (Comité van Dierproeven bij de UCM en Milieubegeleiding van de Comunidad de Madrid, protocolnummer: PROEX 005.0/21) en voldoen aan de regels en Spaanse voorschriften van de Max Planck Society en volgen de EU-richtlijnen voor dierenwelzijn.
1. In vivo metabole etikettering met ANL
<ol><li>...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

De kritische aspecten van het protocol zijn; de opname van negatieve controles, met voldoende biologische replicaties, ANL-toedieningsroute, hoeveelheid en duur, alkylering van de monsters, alkynconcentratie en eliminatie van β-mercaptoethanol bij gebruik van DST-alkyn.
Het is van cruciaal belang om negatieve controlemonsters op te nemen die afkomstig zijn van ANL-gelabelde dieren zonder Cre-driver en dus geen MetRS*-expressie. Deze monsters moeten worden onderworpen aan elke stap die in het ...

Afwijkende eiwithomeostase wordt veroorzaakt door een onbalans in eiwitsynthese en -afbraak. Verschillende ziekten zijn gerelateerd aan veranderingen in eiwithomeostase. Het kenmerk van sommige ziekten is de aanwezigheid van aggregaten op verschillende subcellulaire locaties en hersengebieden. Eiwithomeostase is niet alleen belangrijk bij ziekte, maar speelt ook een cruciale rol in de normale orgaan- en cellulaire functie1. Eiwitsynthese is bijvoorbeeld noodzakelijk voor vele vormen van neuronale plasticiteit 2,3, zoals bepaald door het gebruik van chemische remmers die eiwitsynthese blokkeren4. Het is echter niet duidelijk in welke celtypen het proteoom wordt gewijzigd om leren en geheugen te ondersteunen, noch wordt begrepen welke specifieke eiwitten in elk celtype toenemen of afnemen in hun synthese of afbraak. Een uitgebreide studie van eiwithomeostase vereist dus het vermogen om proteomen te onderscheiden die afkomstig zijn van specifieke celtypen. Inderdaad, de identificatie van celtype-specifieke proteomen om cellulaire processen te bestuderen die plaatsvinden in een meercellige omgeving is een belangrijke hindernis geweest in proteomics. Om deze reden hebben we een techniek ontwikkeld met behulp van MetRS* expressie in combinatie met bio-orthogonale methoden die bewezen heeft een effectieve manier te zijn om celtype specifieke proteomen te identificeren en te zuiveren, waardoor deze kloof 5,6,7 wordt opgevuld.
De expressie van een mutant MetRS* (MetRS L274G) maakt het mogelijk om het niet-canonieke methionine-analoog ANL in het overeenkomstige tRNA 8,9 te laden en vervolgens in eiwitten op te nemen. Wanneer metRS*-expressie wordt gereguleerd door een celtypespecifieke promotor, wordt het niet-canonieke aminozuur op een celselectieve manier in de eiwitten opgenomen. Zodra ANL in de eiwitten is opgenomen, kan het selectief worden gefunctionaliseerd door klikchemie en vervolgens worden gevisualiseerd door beeldvorming (FUNCAT) of door Western Immunoblot (BONCAT). Als alternatief kunnen eiwitten selectief worden gezuiverd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Met behulp van deze technologie creëerden we een muislijn die het MetRS*-eiwit tot expressie brengt onder controle van het Cre-recombinase. Gezien het toenemende aantal beschikbare Cre-muislijnen, kan het MetRS*-systeem op elk gebied worden gebruikt om elk celtype te bestuderen uit elk weefsel waarvoor een bestaande Cre-lijn bestaat. Eiwitetikettering met ANL is mogelijk in vitro of in vivo en verandert het gedrag van de muis of de eiwitintegriteit niet6. De etiketteringstijdspanne kan worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag van elke onderzoeker, waarbij nieuw gesynthetiseerde eiwitten (kortere etiketteringstijden) of hele proteomen (langere etiketteringstijden) worden geëtiketteerd. Het gebruik van deze techniek wordt beperkt door het aantal cellen van het type dat de onderzoeker bereid is te bestuderen; vandaar dat eiwitisolatie van celtypen met lage aantallen of lage stofwisselingen niet mogelijk is met deze methode. Het doel van de gepresenteerde methode is om celtype-specifieke eiwitten /proteomen te identificeren die in vivo zijn gelabeld. In dit protocol beschrijven we hoe we celtypespecifieke proteomen kunnen labelen met ANL in levende muizen en de gelabelde eiwitten kunnen zuiveren. Na zuivering kunnen eiwitten worden geïdentificeerd door routinematige massaspectrometrieprotocollen 5,10. De vermindering van de complexiteit van het monster die in deze methode wordt bereikt door de selectieve zuivering van eiwitten uit specifieke cellulaire populaties, stelt de experimentator in staat om subtiele veranderingen in proteomen te detecteren, bijvoorbeeld als reactie op veranderingen in de omgeving. Zuivering van de gelabelde eiwitten kan worden bereikt in ~ 10 dagen, exclusief de MS-analyse of de etiketteringsperiode. Hier beschrijven we twee methoden voor ANL-toediening aan MetRS * die muizen tot expressie brengen, namelijk (1) het toevoegen van het aminozuur in het drinkwater en (2) het introduceren van ANL door intraperitoneale injecties. Ongeacht de gekozen methode voor ANL-toediening, zijn de isolatie- en zuiveringsstappen hetzelfde (vanaf stap 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Het begrijpen van eiwithomeostase in vivo is de sleutel om te weten hoe de cellen werken in zowel fysiologische als ziekteomstandigheden. Het huidige protocol beschrijft in vivo etikettering en daaropvolgende zuivering van nieuw gesynthetiseerde eiwitten met behulp van een gemanipuleerde muislijn om eiwitetikettering naar specifieke cellulaire populaties te leiden. Het is een induceerbare lijn door Cre-recombinase-expressie van L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*), waardoor azidonorleucine (ANL) kan worden opgenomen in de eiwitten, die anders niet zullen optreden. Met behulp van de hier beschreven methode is het mogelijk om celtypespecifieke proteomen die in vivo zijn gelabeld te zuiveren en subtiele veranderingen in het eiwitgehalte te detecteren als gevolg van vermindering van de complexiteit van het monster.

Volgens het beschreven protocol (samengevat in figuur 1) werd ANL toegediend aan muizen, hetzij door dagelijkse intraperitoneale injecties (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) gedurende 7 dagen, of via drinkwater (0,7% Maltose, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) gedurende 21 dagen. Na het labelen werden de overeenkomstige hersengebieden ontleed, gelyseerd, gealkyleerd en geklikt. Klikreacties werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Western Immunoblot. Representatieve beelde...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.

Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Dit protocol maakt het mogelijk om eiwitten op een celtype specifieke manier te labelen. Dit is de eerste techniek die een dergelijke mogelijkheid biedt en het kan in vitro of in vivo worden gedaan. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat de gelabelde celtypespecifieke eiwitten ongeïdentificeerd kunnen worden gezuiverd of in situ kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorescentie.Om te beginnen met het voorbereiden van het weefsel lysaat door het toevoegen van lysis buffer op een volume van 12 tot 15 keer het natte gewicht van het weefsel en triturate het weefsel totdat het is gehomogeniseerd. Verwarm dit homogenaat gedurende 15 minuten tot 75 graden Celsius om het eiwit te denatureren, centrifugeer vervolgens het monster en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Dit monster kan worden bewaard bij min 80 graden Celsius.Verdun vervolgens voor alkylering het gehomogeniseerde monster twee tot drie keer in fosfaatzoutbuffer met een EDTA-vrije proteaseremmer. Voeg vervolgens vers bereid jodoacetamide toe aan een uiteindelijke concentratie van 20 millimol. Laat het monster één tot twee uur bij 20 graden Celsius in het donker staan.Herhaal de iodoacetamide-toevoegings- en incubatiestappen tweemaal. Bereid de kolom voor volgens de instructies van de fabrikant door eerst de kolommen te vortexen. Verwijder vervolgens het deksel dat het onderste deel snijdt en centrifugeert.Voer vervolgens een bufferuitwisseling uit door eerst de bufferuitwisselingskolommen in evenwicht te brengen met behulp van de click chemistry exchange buffer en vervolgens alle gealkyleerde monsters uit te wisselen. Om de azidonorleucine-opname te evalueren, neemt u 40 microliter van het alluded monster en voegt u fosfaatzoutbuffer toe aan een eindvolume van 120 microliter. Stel vervolgens de klikchemiereactie in door de reactie gedurende 20 seconden te vortexen.Nadat u elk reagens zo snel mogelijk in de aangegeven volgorde hebt toegevoegd, incubeert u de monsters in het donker bij vier graden Celsius 's nachts met continue rotatie. De volgende dag centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten op 17.000 keer G na centrifugatie zal een licht turquoise pellet zichtbaar zijn. Breng het supernatant over in een nieuwe buis en bewaar het monster bij min 80 graden Celsius.Voor gelabelde eiwitzuivering. Onderwerp alle monsters aan een bufferuitwisselingsprocedure zoals aangetoond om restjes vrij alkyn te reinigen met behulp van neutravidinebindingsbuffer als evenwichtsbuffer. Was vervolgens de neutravidine kralen met hoge capaciteit drie keer door de kralen te mengen met de bindingsbuffer.Centrifugeer het mengsel, gooi het supernatant weg en herhaal dit drie keer. Bereid vervolgens een één-op-één slurry voor door hetzelfde volume neutravidine droge kralen en neutravidinebindingsbuffer toe te voegen. Zet 20 tot 40 microliter van elk monster opzij als voorgezuiverd lysaat en bewaar het bij min 20 graden Celsius.Meng na het meten van de eiwitconcentratie van het monster één milligram eiwit met 40 microliter van de kralen slurry. Incubeer het mengsel een nacht op vier graden Celsius met continue rotatie waardoor de gelabelde eiwitten zich aan de kralen kunnen binden. Verzamel de volgende dag het supernatant door centrifugatie.Zet een aliquot van 20 tot 40 microliter van het supernatant opzij voor latere analyse en vries de rest in op min 80 graden Celsius. Was vervolgens de kralen drie keer door gekoelde neutravidinewasbuffer één toe te voegen. Sedimenteren van de kralen en weggooien van het supernatant.Voeg vervolgens dezelfde buffer toe en incubeer de kralen gedurende 10 minuten onder continue rotatie bij vier graden Celsius voordat u het supernatant weggooit. Herhaal de was met neutravidinewasbuffers twee en drie en eluuteer de geklikte eiwitten door de kralen gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius te incuberen met een volume neutravidine-elutiebuffer, overeenkomend met één volume van de gebruikte droge kralen. Houd tijdens de elutie de kralen in suspensie op 1000 omwentelingen per minuut in een thermoblokschudder twee keer en combineer beide eluuten.Klikreacties werden geanalyseerd door SDS-pagina en Western immuno blot. Representatieve beelden van de experimenten worden getoond voor toediening van azidonorleucine via intraperitoneale injectie en voor toediening van azidonorleucine via drinkwater. Een ander experiment biedt een voorbeeld voor de bepaling van de optimale disulfide biotine splijtbare alkynconcentratie.In dit voorbeeld is de vouwverandering tussen het gelabelde monster en de controle het hoogst bij een alkynconcentratie van 14 micromolelars. Een voorbeeld van een massaspectrometrieresultaat met een duidelijke verrijking in het azidonorleucine-gelabelde monster in vergelijking met de controle wordt hier weergegeven. Dit verschil was al zichtbaar in de totale eiwitvlek.Naast veranderingen in peptide-intensiteit zijn er ook unieke eiwitten gevonden in beide monsters. Dit is een technisch complex protocol en het is een stap die zorgvuldig moet worden gevolgd met behulp van de juiste negatieve controles alkylering, de juiste (onduidelijke) en adequate reiniging van het non-click archief. Onze belangrijkste stappen in dit protocol, gezuiverde eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door massaspectrometrie als de onderzoekers geïnteresseerd zijn in het bestuderen van eiwitten of het laden in een gel voor het bestuderen van eiwitten van belang door western blot.Het vermogen van deze methode om eiwitten van een specifieke cellulaire oorsprong te labelen, heeft veel toepassingen, zoals de spanning van eiwitten of de studie van eiwitsynthese in vitro of in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Identificatie van specifieke Sensory Neuron Populaties voor Studie van Uitgedrukt Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Zuivering van Mouse Brain Schepen

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Zuivering van Prominin-1+ Stamcellen van postnatale muis Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...