Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line at JoVE.com

B.A-C est financé par le ministère espagnol de la Science et de l’Innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), par la Communauté autonome de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) et par les subventions MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P est financé par la Communauté autonome de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. est financé par la Société Max Planck, une bourse de chercheur avancé du Conseil européen de la recherche (subvention 743216), DFG CRC 1080: Mécanismes moléculaires et cellulaires de l’homéostasie neurale, et DFG CRC 902: Principes moléculaires de régulation basée sur l’ARN. Nous remercions D.C Dieterich et P. Landgraf pour leurs conseils techniques et la synthèse du DST-Alcyne. Nous remercions E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast et l’animalerie du MPI for Brain Research pour leur excellent soutien. Nous remercions Sandra Goebbels d’avoir partagé la gamme de souris Nex-Cre. Nous remercions Antonio G. Carroggio pour son aide avec l’édition anglaise. B.A-C. conçu, mené et analysé des expériences. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. et S. t. D. a mené et analysé des expériences. B.A-C et E.M.S. ont conçu des expériences et supervisé le projet, B.A-C a écrit l’article. Tous les auteurs ont édité l’article.

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées avec l’autorisation des bureaux du gouvernement local en Allemagne (RP Darmstadt; protocoles: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) ou en Espagne (Comité d’expérimentation animale de l’UCM et de conseil environnemental de la Comunidad de Madrid, numéro de protocole: PROEX 005.0/21) et sont conformes aux règles de la Société Max Planck et aux réglementations espagnoles et suivent les directives de l’UE pour le bien-être animal.
<p cl...

<ol>
	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

Les aspects critiques du protocole sont les suivants : l’inclusion de témoins négatifs, ayant suffisamment de réplicats biologiques, la voie d’administration ANL, la quantité et la durée, l’alkylation des échantillons, la concentration d’alcyne et l’élimination du β-mercaptoéthanol lors de l’utilisation de DST-alcyne.
Il est essentiel d’inclure des échantillons témoins négatifs provenant d’animaux marqués ANL sans pilote Cre et donc sans expression MetRS*. Ces éch...

L’homéostasie protéique aberrante est causée par un déséquilibre dans la synthèse et la dégradation des protéines. Plusieurs maladies sont liées à des altérations de l’homéostasie des protéines. La caractéristique de certaines maladies est la présence d’agrégats dans différents endroits subcellulaires et zones du cerveau. L’homéostasie des protéines est non seulement importante dans la maladie, mais joue également un rôle crucial dans la fonction organique et cellulaire normale1. Par exemple, la synthèse des protéines est nécessaire pour de nombreuses formes de plasticité neuronale2,3, telle que déterminée par l’utilisation d’inhibiteurs chimiques qui bloquent la synthèse des protéines4. Cependant, il n’est pas clair dans quels types de cellules le protéome est modifié pour soutenir l’apprentissage et la mémoire, ni quelles protéines spécifiques dans chaque type cellulaire augmentent ou diminuent dans leur synthèse ou leur dégradation. Ainsi, une étude approfondie de l’homéostasie des protéines nécessite la capacité de différencier les protéomes provenant de types cellulaires spécifiques. En effet, l’identification de protéomes spécifiques au type cellulaire pour étudier les processus cellulaires se produisant dans un environnement multicellulaire a été un obstacle important en protéomique. Pour cette raison, nous avons développé une technique utilisant l’expression MetRS* combinée à des méthodes bio-orthogonales qui s’est avérée être un moyen efficace d’identifier et de purifier des protéomes spécifiques de type cellulaire, comblant cette lacune 5,6,7.
L’expression d’un mutant MetRS* (MetRS L274G) permet le chargement de l’analogue non canonique de la méthionine ANL dans l’ARNt 8,9 correspondant et son incorporation ultérieure dans les protéines. Lorsque l’expression de MetRS* est régulée par un promoteur spécifique au type cellulaire, l’acide aminé non canonique sera incorporé dans les protéines de manière sélective des cellules. Une fois que l’ANL est incorporée dans les protéines, elle peut être fonctionnalisée sélectivement par la chimie du clic et ensuite visualisée par imagerie (FUNCAT) ou par Western Immunoblot (BONCAT). Alternativement, les protéines peuvent être purifiées sélectivement et identifiées par spectrométrie de masse (MS). Grâce à cette technologie, nous avons créé une lignée de souris exprimant la protéine MetRS* sous le contrôle de la Cre recombinase. Compte tenu du nombre croissant de lignées Cre-mouse disponibles, le système MetRS* peut être utilisé dans n’importe quel domaine pour étudier n’importe quel type de cellule à partir de n’importe quel tissu pour lequel il existe une Cre-line. Le marquage des protéines avec ANL est possible in vitro ou in vivo, et ne modifie pas le comportement de la souris ou l’intégrité des protéines6. La durée de marquage peut être adaptée à la question scientifique de chaque chercheur, en marquant des protéines nouvellement synthétisées (temps de marquage plus courts) ou des protéomes entiers (temps de marquage plus longs). L’utilisation de cette technique est limitée par le nombre de cellules du type que le chercheur est prêt à étudier; Par conséquent, l’isolement des protéines à partir de types cellulaires à faible nombre ou à faible taux métabolique n’est pas possible par cette méthode. L’objectif de la méthode présentée est d’identifier des protéines/protéomes spécifiques au type cellulaire marqués in vivo. Dans ce protocole, nous décrivons comment marquer des protéomes spécifiques au type cellulaire avec ANL chez des souris vivantes et purifier les protéines marquées. Après purification, les protéines peuvent être identifiées par des protocoles de spectrométrie de massede routine 5,10. La réduction de la complexité de l’échantillon obtenue dans cette méthode par la purification sélective de protéines provenant de populations cellulaires spécifiques permet à l’expérimentateur de détecter des changements subtils dans les protéomes, par exemple, en réponse à des changements environnementaux. La purification des protéines marquées peut être réalisée en ~10 jours, sans compter l’analyse MS ou la période de marquage. Ici, nous décrivons deux méthodes d’administration d’ANL à des souris exprimant MetRS*, à savoir (1) l’ajout d’acide aminé dans l’eau potable et (2) l’introduction de LNA par injections intrapéritonéales. Quelle que soit la méthode choisie pour l’administration de l’ANL, les étapes d’isolement et de purification sont les mêmes (à partir de l’étape 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Comprendre l’homéostasie des protéines in vivo est essentiel pour savoir comment les cellules fonctionnent dans des conditions physiologiques et pathologiques. Le présent protocole décrit le marquage in vivo et la purification ultérieure de protéines nouvellement synthétisées à l’aide d’une lignée de souris modifiée pour diriger le marquage des protéines vers des populations cellulaires spécifiques. Il s’agit d’une lignée inductible par l’expression de la Cre recombinase de L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*), permettant l’incorporation d’azidonorleucine (ANL) aux protéines, ce qui ne se produirait pas autrement. En utilisant la méthode décrite ici, il est possible de purifier des protéomes spécifiques au type cellulaire marqués in vivo et de détecter des changements subtils dans la teneur en protéines dus à la réduction de la complexité de l’échantillon.

Après le protocole décrit (résumé à la figure 1), l’ANL a été administrée à des souris soit par injections intrapéritonéales quotidiennes (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) pendant 7 jours, soit par eau potable (0,7 % de Maltose, 1 % ANL, CamkII-Cre::MetRS*) pendant 21 jours. Après l’étiquetage, les zones cérébrales correspondantes ont été disséquées, lysées, alkylées et cliquées. Les réactions aux clics ont été analysées par SDS-P...

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Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Ce protocole décrit comment effectuer le marquage de protéines spécifiques au type cellulaire avec l’azidonorleucine (ANL) à l’aide d’une lignée de souris exprimant une synthétase d’ARNt L274G-méthionine mutante (MetRS*) et les étapes nécessaires pour isoler des protéines marquées spécifiques au type cellulaire. Nous décrivons deux voies d’administration possibles d’ANL chez des souris vivantes par (1) l’eau potable et (2) les injections intrapéritonéales.

Purification et identification de protéines spécifiques de type cellulaire à partir de tissus complexes à l’aide d’une lignée de souris mutante d’ARNt synthétase de méthionine

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Ce protocole permet de marquer les protéines d’une manière spécifique au type cellulaire. C’est la première technique qui offre une telle possibilité et elle peut être réalisée in vitro ou in vivo. Le principal avantage de la technique est que les protéines spécifiques du type de cellule marqué peuvent être purifiées non identifiées ou visualisées in situ par immunofluorescence.Pour commencer, préparez le lysat tissulaire en ajoutant un tampon de lyse à un volume de 12 à 15 fois le poids humide du tissu et triturez le tissu jusqu’à ce qu’il soit homogénéisé. Chauffer cet homogénat pendant 15 minutes à 75 degrés Celsius pour dénaturer la protéine, puis centrifuger l’échantillon et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Cet échantillon peut être conservé à moins 80 degrés Celsius.Ensuite, pour l’alkylation, diluer l’échantillon homogénéisé deux à trois fois dans un tampon saline de phosphate contenant un inhibiteur de protéase sans EDTA. Ajoutez ensuite de l’iodoacétamide fraîchement préparé jusqu’à une concentration finale de 20 millimoles. Laissez l’échantillon pendant une à deux heures à 20 degrés Celsius dans l’obscurité.Répétez deux fois les étapes d’ajout et d’incubation d’iodoacétamide. Préparez la colonne selon les instructions du fabricant en faisant d’abord tourbillonner les colonnes. Ensuite, retirez le couvercle en coupant la partie inférieure et en les centrifugeant.Ensuite, effectuez un échange de tampon en équilibrant d’abord les colonnes d’échange de tampon à l’aide du tampon d’échange de chimie de clic, puis en échangeant tous les échantillons alkylés. Pour évaluer l’incorporation d’azidonorleucine, prélever 40 microlitres de l’échantillon mentionné et ajouter un tampon de phosphate salin à un volume final de 120 microlitres. Ensuite, configurez la réaction de chimie de clic en tourbillonnant la réaction pendant 20 secondes.Après avoir ajouté chaque réactif dans l’ordre indiqué le plus rapidement possible, incuber les échantillons dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec une rotation continue. Le lendemain, centrifuger les échantillons pendant cinq minutes à 17 000 fois G après centrifugation une pastille légèrement turquoise sera visible. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et conserver l’échantillon à moins 80 degrés Celsius.Pour la purification des protéines étiquetées. Soumettre tous les échantillons à une procédure d’échange tampon comme démontré pour nettoyer les restes d’alcyne libre en utilisant un tampon de liaison à la neutravidine comme tampon d’équilibre. Ensuite, lavez les perles de haute capacité neutravidine trois fois en mélangeant les perles avec le tampon de liaison.Centrifuger le mélange, jeter le surnageant et répéter cette opération trois fois. Préparez ensuite une suspension individuelle en ajoutant le même volume de billes sèches de neutravidine et de tampon de liaison de neutravidine. Réservez 20 à 40 microlitres de chaque échantillon comme lysat pré-purifié et conservez-le à moins 20 degrés Celsius.Après avoir mesuré la concentration en protéines de l’échantillon, mélangez un milligramme de protéines avec 40 microlitres de boue de billes. Incuber le mélange pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une rotation continue permettant aux protéines marquées de se lier aux billes. Le lendemain, prélever le surnageant par centrifugation.Mettez de côté une partie aliquote de 20 à 40 microlitres du surnageant pour une analyse ultérieure et congelez le reste à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, lavez les perles trois fois en ajoutant un tampon de lavage de neutravidine réfrigéré. Sédimenter les perles et jeter le surnageant.Ajoutez ensuite le même tampon et incuber les billes pendant 10 minutes en rotation continue à quatre degrés Celsius avant de jeter le surnageant. Répéter le lavage avec les tampons de lavage de neutravidine deux et trois, et éluer les protéines cliquetées en incubant les billes pendant 30 minutes à 20 degrés Celsius avec un volume de tampon d’élution de neutravidine, correspondant à un volume des billes sèches utilisées. Pendant l’élution, maintenir les billes en suspension à 1000 tours par minute dans un agitateur thermobloc éluder deux fois et combiner les deux élus.Les réactions au clic ont été analysées par page SDS et Western immuno blot. Des images représentatives des expériences sont présentées pour l’administration d’azidonorleucine par injection intrapéritonéale et pour l’administration d’azidonorleucine par eau potable. Une autre expérience fournit un exemple pour la détermination de la concentration optimale d’alcyne clivable en disulfure de biotine.Dans cet exemple, le changement de pli entre l’échantillon marqué et le témoin est le plus élevé à 14 concentrations d’alcyne micromolaire. Un exemple de résultat de spectrométrie de masse avec un enrichissement clair dans l’échantillon marqué à l’azidonorleucine par rapport au témoin est montré ici. Cette différence était déjà visible dans la coloration protéique totale.Outre les changements d’intensité peptidique, il existe également des protéines uniques trouvées dans les deux échantillons. Il s’agit d’un protocole techniquement complexe et c’est une étape qui doit être soigneusement suivie en utilisant une alkylation de contrôle négatif appropriée, un nettoyage approprié (indistinct) et adéquat de l’archive sans clic. Nos étapes clés dans ce protocole, les protéines purifiées peuvent être identifiées soit par spectrométrie de masse si l’intérêt des chercheurs est d’étudier les protéines, soit les charger dans un gel pour étudier les protéines d’intérêt par transfert Western.La capacité de cette méthode à marquer des protéines d’origine cellulaire spécifique a de nombreuses applications telles que la tension des protéines ou l’étude de la synthèse des protéines in vitro ou in vivo.

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