Name: cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00
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B.A-C wird vom spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) und MICINN (PID2020-113270RA-I00) finanziert. R. A-P wird von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) finanziert. E.M.S. wird gefördert durch die Max-Planck-Gesellschaft, einen Advanced Investigator Award des Europäischen Forschungsrats (grant 743216), den DFG-SFB 1080: Molekulare und zelluläre Mechanismen der neuronalen Homöostase und den DFG-SFB 902: Molekulare Prinzipien der RNA-basierten Regulation. Wir danken D.C. Dieterich und P. Landgraf für ihre technische Beratung und die Synthese des DST-Alkin. Wir danken E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast und der Tiereinrichtung des MPI für Hirnforschung für die hervorragende Unterstützung. Wir danken Sandra Goebbels für das Teilen der Nex-Cre Mauslinie. Wir danken Antonio G. Carroggio für seine Hilfe bei der englischen Redaktion. B.A-C. entwarf, führte und analysierte Experimente. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. und S. t. D. führte Experimente durch und analysierte sie. B.A-C und E.M.S. entwarfen Experimente und überwachten das Projekt, B.A-C schrieb das Papier. Alle Autoren haben das Papier bearbeitet.

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der lokalen Regierungsstellen in Deutschland (RP Darmstadt; Protokolle: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) oder Spanien (Ausschuss für Tierversuche an der UCM und Umweltberatung der Comunidad de Madrid, Protokollnummer: PROEX 005.0/21) durchgeführt und entsprechen den Regeln der Max-Planck-Gesellschaft und den spanischen Vorschriften sowie den EU-Richtlinien für den Tierschutz.
1. In vivo metabolische Markierung mit ANL</str...

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	<li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+synaptic+protein+turnover.">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+protein+synthesis,+synaptic+plasticity,+and+memory.">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li><li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons.">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939 (2020).</li><li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin.">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li><li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling,+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li><li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo.">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li><li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins.">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li><li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis.">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li><li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li><li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches.">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li><li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BONCAT:+Metabolic+labeling,+click+chemistry,+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes.">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).</li><li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+by+immunoblotting.">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li><li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition.">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li><li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li><li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition.">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li><li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+of+proteins.">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+trapping+(S-Trap)+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics.">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li><li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ.">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li><li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation.">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li><li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome.">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377 (2016).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioID:+A+screen+for+protein-protein+interactions.">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li></ol>

Die kritischen Aspekte des Protokolls sind: die Einbeziehung von Negativkontrollen, genügend biologische Replikate, ANL-Verabreichungsweg, Menge und Dauer, Alkylierung der Proben, Alkinkonzentration und β-Mercaptoethanol-Eliminierung bei Verwendung von DST-Alkin.
Es ist wichtig, Negativkontrollproben von ANL-markierten Tieren ohne Cre-Treiber und daher ohne MetRS*-Expression einzubeziehen. Diese Proben müssen jedem im Protokoll beschriebenen Schritt parallel zu den Proben von ANL-markierten...

Aberrante Proteinhomöostase wird durch ein Ungleichgewicht in der Proteinsynthese und -abbau verursacht. Mehrere Krankheiten stehen im Zusammenhang mit Veränderungen der Proteinhomöostase. Das Kennzeichen einiger Krankheiten ist das Vorhandensein von Aggregaten an verschiedenen subzellulären Orten und Gehirnbereichen. Die Proteinhomöostase ist nicht nur bei Krankheiten wichtig, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei der normalen Organ- und Zellfunktion1. Zum Beispiel ist die Proteinsynthese für viele Formen der neuronalen Plastizitätnotwendig 2,3, wie durch die Verwendung chemischer Inhibitoren bestimmt, die die Proteinsynthese blockieren4. Es ist jedoch weder klar, bei welchen Zelltypen das Proteom verändert wird, um Lernen und Gedächtnis zu unterstützen, noch ist bekannt, welche spezifischen Proteine in jedem Zelltyp ihre Synthese oder ihren Abbau erhöhen oder verringern. Daher erfordert eine umfassende Untersuchung der Proteinhomöostase die Fähigkeit, Proteome aus bestimmten Zelltypen zu unterscheiden. Tatsächlich war die Identifizierung zelltypspezifischer Proteome zur Untersuchung zellulärer Prozesse, die in einer mehrzelligen Umgebung ablaufen, eine wichtige Hürde in der Proteomik. Aus diesem Grund haben wir eine Technik entwickelt, die MetRS*-Expression in Kombination mit bioorthogonalen Methoden verwendet, die sich als effektiver Weg zur Identifizierung und Reinigung zelltypspezifischer Proteome erwiesen hat und diese Lücke füllt 5,6,7.
Die Expression eines mutierten MetRS* (MetRS L274G) ermöglicht das Laden des nicht-kanonischen Methionin-Analogons ANL in die entsprechende tRNA 8,9 und dessen anschließenden Einbau in Proteine. Wenn die MetRS*-Expression durch einen zelltypspezifischen Promotor reguliert wird, wird die nicht-kanonische Aminosäure zellselektiv in die Proteine eingebaut. Sobald ANL in die Proteine eingebaut ist, kann es selektiv durch Klickchemie funktionalisiert und anschließend entweder durch Bildgebung (FUNCAT) oder durch Western Immunoblot (BONCAT) sichtbar gemacht werden. Alternativ können Proteine selektiv gereinigt und mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. Mit dieser Technologie haben wir eine Mauslinie erstellt, die das MetRS*-Protein unter der Kontrolle der Cre-Rekombinase exprimiert. Angesichts der steigenden Anzahl verfügbarer Cre-Maus-Linien kann das MetRS*-System in jedem Bereich verwendet werden, um jeden Zelltyp aus jedem Gewebe zu untersuchen, für das es eine bestehende Cre-Linie gibt. Die Proteinmarkierung mit ANL ist in vitro oder in vivo möglich und verändert weder das Verhalten der Maus noch die Proteinintegrität6. Die Markierungszeit kann an die wissenschaftliche Fragestellung jedes Forschers angepasst werden, indem neu synthetisierte Proteine (kürzere Markierungszeiten) oder ganze Proteome (längere Markierungszeiten) markiert werden. Die Verwendung dieser Technik ist durch die Anzahl der Zellen des Typs begrenzt, den der Forscher zu untersuchen bereit ist; Daher ist eine Proteinisolierung aus Zelltypen mit geringer Anzahl oder niedrigen Stoffwechselraten mit dieser Methode nicht möglich. Ziel der vorgestellten Methode ist es, zelltypspezifische Proteine/Proteome zu identifizieren, die in vivo markiert sind. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zelltypspezifische Proteome mit ANL in lebenden Mäusen markiert und die markierten Proteine gereinigt werden. Nach der Reinigung können Proteine durch routinemäßige Massenspektrometrieprotokolle 5,10 identifiziert werden. Die Reduzierung der Probenkomplexität, die bei dieser Methode durch die selektive Reinigung von Proteinen aus bestimmten Zellpopulationen erreicht wird, ermöglicht es dem Experimentator, subtile Veränderungen in Proteomen zu erkennen, beispielsweise als Reaktion auf Umweltveränderungen. Die Reinigung der markierten Proteine kann in ~10 Tagen erreicht werden, ohne die MS-Analyse oder die Markierungsperiode. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur ANL-Verabreichung an MetRS*-exprimierende Mäuse, nämlich (1) Zugabe der Aminosäure im Trinkwasser und (2) Einführung von ANL durch intraperitoneale Injektionen. Unabhängig von der für die ANL-Verabreichung gewählten Methode sind die Isolations- und Reinigungsschritte die gleichen (ab Schritt 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12% Acrylamide gels</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANL-HCl</td>
			<td>IrishBotech</td>
			<td>HAA1625.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin alkyne</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>B10185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken antibody anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Toxic; use a lab coat and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (I) bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>254185</td>
			<td>99.999% (wt/wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disulfide tag (DST)-alkyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Merk</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodo acetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti chicken 800</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 800CW</td>
			<td>Donkey anti-Chicken Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR anti rabit 680</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>IRDye 680RD</td>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mixer</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4259</td>
			<td>Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>29200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J62036.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X pH 7.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation described in reference number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD SpinTrap G-25 columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo,</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-biotin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE&#160; Running buffer MOPS</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>M00138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table automatic Vortexer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mixmate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triazole ligand</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-type specific protein purification and identification from complex tissues using a mutant methionine trna synthetase mouse line

Das Verständnis der Proteinhomöostase in vivo ist der Schlüssel zum Wissen, wie die Zellen sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitsbedingungen funktionieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt die In-vivo-Markierung und anschließende Reinigung neu synthetisierter Proteine unter Verwendung einer manipulierten Mauslinie, um die Proteinmarkierung an bestimmte Zellpopulationen zu richten. Es handelt sich um eine induzierbare Linie durch Cre-Rekombinase-Expression der L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*), die einen Einbau von Azidonorleucin (ANL) in die Proteine ermöglicht, der sonst nicht auftritt. Mit der hier beschriebenen Methode ist es möglich, zelltypspezifische Proteome, die in vivo markiert sind, zu reinigen und subtile Veränderungen des Proteingehalts aufgrund der Reduktion der Probenkomplexität zu erkennen.

Gemäß dem beschriebenen Protokoll (zusammengefasst in Abbildung 1) wurde ANL Mäusen entweder durch tägliche intraperitoneale Injektionen (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) für 7 Tage oder über Trinkwasser (0,7% Maltose, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) für 21 Tage verabreicht. Nach der Markierung wurden die entsprechenden Hirnareale seziert, lysiert, alkyliert und angeklickt. Klickreaktionen wurden von SDS-PAGE und Western Immunoblot analysiert. Repräsentativ...

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Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine zelltypspezifische Proteinmarkierung mit Azidonorleucin (ANL) unter Verwendung einer Mauslinie durchgeführt wird, die eine mutierte L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*) exprimiert, und die notwendigen Schritte zur Isolierung markierter zelltypspezifischer Proteine. Wir skizzieren zwei mögliche ANL-Verabreichungswege bei lebenden Mäusen durch (1) Trinkwasser und (2) intraperitoneale Injektionen.

Zelltypspezifische Proteinreinigung und Identifizierung aus komplexen Geweben unter Verwendung einer mutierten Methionin-tRNA-Synthetase-Mauslinie

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, Proteine zelltypspezifisch zu markieren. Dies ist die erste Technik, die eine solche Möglichkeit bietet, und sie kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass die markierten zelltypspezifischen Proteine unidentifiziert gereinigt oder in situ durch Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden können.Um mit der Vorbereitung des Gewebelysats zu beginnen, wird ein Lysepuffer mit einem Volumen von 12 bis 15 mal dem Nassgewicht des Gewebes hinzugefügt und das Gewebe trituiert, bis es homogenisiert ist. Erhitzen Sie dieses Homogenat für 15 Minuten auf 75 Grad Celsius, um das Protein zu denaturieren, zentrifugieren Sie dann die Probe und übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Diese Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Anschließend wird die homogenisierte Probe zur Alkylierung zwei- bis dreimal in einem Phosphatsalzpuffer verdünnt, der einen EDTA-freien Proteaseinhibitor enthält. Dann fügen Sie frisch zubereitetes Jodoacetamid zu einer Endkonzentration von 20 Millimol hinzu. Lassen Sie die Probe ein bis zwei Stunden bei 20 Grad Celsius im Dunkeln.Wiederholen Sie die Schritte der Iodoacetamid-Addition und -Inkubation zweimal. Bereiten Sie die Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, indem Sie zuerst die Säulen wirbeln. Dann den Deckel entfernen, den unteren Teil schneiden und zentrifugieren.Führen Sie als Nächstes einen Pufferaustausch durch, indem Sie zuerst die Pufferaustauschsäulen mit dem Klickchemieaustauschpuffer ausgleichen und dann alle alkylierten Proben austauschen. Um den Azidonorleucin-Einbau zu bewerten, nehmen Sie 40 Mikroliter der angedeuteten Probe und fügen Sie Phosphatsalzlösungspuffer zu einem Endvolumen von 120 Mikrolitern hinzu. Richten Sie dann die Klickchemiereaktion ein, indem Sie die Reaktion 20 Sekunden lang durchwirbeln.Nachdem Sie jedes Reagenz in der angegebenen Reihenfolge so schnell wie möglich hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei vier Grad Celsius über Nacht mit kontinuierlicher Rotation. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben für fünf Minuten bei 17.000 mal G nach der Zentrifugation wird ein leicht türkisfarbenes Pellet sichtbar sein. Den Überstand in ein neues Röhrchen überführen und die Probe bei minus 80 Grad Celsius lagern.Zur markierten Proteinreinigung. Alle Proben werden einem Pufferaustauschverfahren unterzogen, wie gezeigt, um Reste von freiem Alkin unter Verwendung eines Neutravidin-Bindungspuffers als Gleichgewichtspuffer zu reinigen. Dann waschen Sie die Neutravidin-Hochleistungsperlen dreimal, indem Sie die Perlen mit dem Bindepuffer mischen.Zentrifugieren Sie die Mischung, verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie dies dreimal. Dann bereiten Sie eine Eins-zu-Eins-Aufschlämmung vor, indem Sie das gleiche Volumen an Neutravidin-Trockenkügelchen und Neutravidin-Bindungspuffer hinzufügen. Von jeder Probe werden 20 bis 40 Mikroliter als vorgereinigtes Lysat beiseite gelegt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert.Nach der Messung der Proteinkonzentration der Probe mischen Sie ein Milligramm Protein mit 40 Mikrolitern der Perlenaufschlämmung. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation, so dass die markierten Proteine an die Perlen binden können. Am folgenden Tag sammeln Sie den Überstand durch Zentrifugieren.Legen Sie ein Aliquot von 20 bis 40 Mikrolitern des Überstands für eine spätere Analyse beiseite und frieren Sie den Rest bei minus 80 Grad Celsius ein. Als nächstes waschen Sie die Perlen dreimal, indem Sie gekühlten Neutravidin-Waschpuffer hinzufügen. Sedimentieren der Perlen und Verwerfen des Überstands.Dann fügen Sie den gleichen Puffer hinzu und brüten Sie die Perlen für 10 Minuten unter kontinuierlicher Rotation bei vier Grad Celsius aus, bevor Sie den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die Wäsche mit den Neutravidin-Waschpuffern zwei und drei und eluieren Sie die angeklickten Proteine, indem Sie die Perlen 30 Minuten lang bei 20 Grad Celsius mit einem Volumen Neutravidin-Elutionspuffer inkubieren, das einem Volumen der verwendeten Trockenkügelchen entspricht. Während der Elution die Perlen bei 1000 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoblock-Shaker zweimal in Schwebe halten und beide Elue kombinieren.Klickreaktionen wurden mittels SDS-Seite und Western Immuno Blot analysiert. Repräsentative Bilder der Experimente werden für die Azidonorleucin-Verabreichung durch intraperitoneale Injektion und für die Azidonorleucin-Verabreichung über Trinkwasser gezeigt. Ein weiteres Experiment liefert ein Beispiel für die Bestimmung der optimalen Disulfidbiotin-spaltbaren Alkinkonzentration.In diesem Beispiel ist die Faltenänderung zwischen der markierten Probe und der Kontrolle bei 14 Mikromolalkinkonzentrationen am höchsten. Ein Beispiel für ein massenspektrometrisches Ergebnis mit einer deutlichen Anreicherung in der mit Azidonorleucin markierten Probe im Vergleich zur Kontrolle ist hier gezeigt. Dieser Unterschied war bereits in der gesamten Proteinfärbung sichtbar.Neben Änderungen der Peptidintensität finden sich in beiden Proben auch einzigartige Proteine. Dies ist ein technisch komplexes Protokoll und es ist ein Schritt, der sorgfältig unter Verwendung geeigneter Negativkontrollen der Alkylierung, der ordnungsgemäßen (undeutlichen) und angemessenen Reinigung des Nicht-Klick-Archivs befolgt werden muss. Unsere wichtigsten Schritte in diesem Protokoll, gereinigte Proteine können entweder durch Massenspektrometrie identifiziert werden, wenn die Forscher daran interessiert sind, Proteine zu untersuchen, oder sie in ein Gel laden, um Proteine von Interesse durch Western Blot zu untersuchen.Die Fähigkeit dieser Methode, Proteine eines bestimmten zellulären Ursprungs zu markieren, hat viele Anwendungen wie die Spannung von Proteinen oder die Untersuchung der Proteinsynthese in vitro oder in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Identifikation von spezifischen sensorischen Neuronenpopulationen für das Studium der Ausgedrückt Ionenkanäle

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Reinigung von Prominin-1+ Stammzellen aus postnatalem Maus-Zerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...